劉良田 許海濤 唐永華

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一, 我國每年死于肝癌的患者超過11萬, 已占我國腫瘤死因的第2位［1］。有資料表明, IRX1、IRX2與肝癌細(xì)胞發(fā)展相關(guān)［2］。本次研究分析肝癌細(xì)胞中IR X1、IRX2表達(dá)情況, 觀察其對細(xì)胞免疫功能的影響, 以期為肝癌的治療提供一個(gè)新的方向?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇本院和光明新區(qū)等醫(yī)院2014年2月～2017年8月收治的60例進(jìn)行HCC手術(shù)患者的新鮮標(biāo)本作為研究對象, 所有患者術(shù)前均未接受放化療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 60例HCC標(biāo)本均取癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)癌肝組織,肉眼觀距腫瘤邊界2 cm以內(nèi)的非癌組織為癌旁組織, 2 cm以上為遠(yuǎn)癌肝組織。所有標(biāo)本離體后立即取0.5 cm×0.5 cm 大小的組織塊, 迅速置于液氮罐中, 于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存, 以備檢測。

1.2.2 臨床資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤大小、是否包膜、腫瘤分化程度、有無鏡下脈管癌栓、復(fù)發(fā)情況、甲胎蛋白(AFP)、是否合并乙肝或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有肝硬化、TNM分期、術(shù)后生存時(shí)間。

1.2.3 SP法檢測 根據(jù)SP檢測說明書按照步驟進(jìn)行操作, 結(jié)果判斷：染色后的切片采取雙盲的方法, 由兩位病理醫(yī)師根據(jù)染色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的百分比, 獨(dú)立進(jìn)行半定量評(píng)分(HSCORE), 若切片 HSCORE＞100 判斷為陽性,HSCORE≤100 判斷為陰性。

1.2.4 RT-PCR檢測 ①總RNA的提取：采用Simply P總RNA提取試劑盒說明書提取兩種細(xì)胞的總RNA。②互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)的合成：按照cDNA合成說明書進(jìn)行。③PCR反應(yīng)及凝膠電泳：根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.3 檢測標(biāo)本及指標(biāo)

1.3.1 肝癌及癌旁組織檢測 以60例肝癌組織和60例癌旁組織為研究對象, 采用RT-PCR法檢測IRX1、IRX2mRNA表達(dá)情況, 采用SP法檢測IRX1、IRX2蛋白表達(dá)情況。

1.3.2 肝癌組織檢測 以60例肝癌組織為研究對象, 采用SP法檢測IRX1、IRX2蛋白表達(dá)情況, 并將60例肝癌組織按照病理分期分為高分化組21例、中分化組20例、低分化組19例, 比較其IRX1、IRX2蛋白表達(dá)差異。

1.4 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將人肝癌細(xì)胞分為IRX1高表達(dá)組、IRX2高表達(dá)組、IRX1正常表達(dá)組及IRX2正常表達(dá)組四組,采用載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染的方式將IRX1、IRX2基因注入人肝癌細(xì)胞中, 使用細(xì)胞增殖 MTT法檢測SMMC-7721細(xì)胞, 在酶聯(lián)儀(Biorad M-550)上測定490 nm波長處的吸光值, 使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況和周期變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s), 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)；采用趨勢卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)分析蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床病理特征間的關(guān)系。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌及癌旁組織檢測

2.1.1 IRX1、IRX2 mRNA表達(dá) mRNA表達(dá)結(jié)果顯示, 肝癌組織中IRX1 mRNA表達(dá)量為(13.81±3.29)明顯高于癌旁組織的(6.52±2.84), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肝癌組織中IRX2 mRNA表達(dá)量為(4.62±1.83)明顯低于癌旁組織的(9.37±2.59), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.1.2 IRX1、IRX2蛋白表達(dá) 肝癌組織中的IRX1蛋白陽性表達(dá)例數(shù)顯著多于癌旁組織, IRX2蛋白陽性表達(dá)例數(shù)少于癌旁組織, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 肺癌及癌旁組織IRX1、IRX2蛋白表達(dá)情況(n)

2.2 肝癌組織檢測 IRX1基因表達(dá)程度與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān), IRX2基因表達(dá)程度與腫瘤分化程度呈正相關(guān)。見表2。

表2 三組肝癌組織IRX1、IRX2表達(dá)情況(n)

2.3 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞增殖變化 IRX1高表達(dá)組37例, IRX1正常表達(dá)組14例, IRX2高表達(dá)組24例,IRX2正常表達(dá)組27例。MTT檢測后IRX1高表達(dá)組A490顯著低于IRX1正常表達(dá)組, IRX2高表達(dá)組A490顯著高于IRX2正常表達(dá)組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞增殖變化( ±s)

表3 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞增殖變化( ±s)

注：與相同基因正常表達(dá)組比較, aP＜0.05

24 h 48 h IRX1高表達(dá)組 37 0.68±0.07a 0.57±0.05a IRX1正常表達(dá)組 14 0.83±0.09 0.74±0.08 IRX2高表達(dá)組 24 0.84±0.10a 0.76±0.08a IRX2正常表達(dá)組 27 0.66±0.06 0.59±0.06組別 例數(shù)A490

2.4 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞凋亡變化 IRX1高表達(dá)組細(xì)胞凋亡總比例顯著高于IRX1正常表達(dá)組, IRX2高表達(dá)組細(xì)胞凋亡總比例顯著低于IRX2正常表達(dá)組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞凋亡變化( ±s)

表4 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞凋亡變化( ±s)

注：與相同基因正常表達(dá)組比較, aP＜0.05

24 h 48 h IRX1高表達(dá)組 37 66.48±6.27a 57.51±5.35a IRX1正常表達(dá)組 14 50.83±5.26 42.74±4.18 IRX2高表達(dá)組 24 52.39±5.43a 41.39±4.11a IRX2正常表達(dá)組 27 61.74±6.10 50.86±5.25組別 例數(shù) 凋亡總比例(%)

2.5 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞周期變化 IRX1高表達(dá)組G0/G1、G2/M期顯著低于IRX1正常表達(dá)組, S期顯著高于IRX1正常表達(dá)組；IRX2高表達(dá)組G0/G1、G2/M期顯著高于IRX2正常表達(dá)組, S期顯著低于IRX2正常表達(dá)組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表5。

表5 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞周期變化( ±s)

表5 IRX1、IRX2不同表達(dá)組細(xì)胞周期變化( ±s)

注：與相同基因正常表達(dá)組比較, aP＜0.05

組別 例數(shù) G0/G1 S G2/M IRX1 高表達(dá)組 37 74.35±5.82a 18.63±1.37a 0.27±0.03a IRX1正常表達(dá)組 14 80.21±6.57 17.35±1.12 1.31±0.15 IRX2 高表達(dá)組 24 81.03±6.62a 17.42±1.15a 1.33±0.17a IRX2正常表達(dá)組 27 73.29±5.76 18.71±1.38 0.31±0.04

3 討論

IRX1、IRX2基因?qū)僖茁蹇易逋春谢? 是一簇與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的基因, 編碼參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的具有轉(zhuǎn)錄因子組合活性的家族蛋白［3］。Rapidis等［4］研究發(fā)現(xiàn), 頭頸癌細(xì)胞株過表達(dá)IRX1基因后, 細(xì)胞增殖和體外形成能力降低。IRX1 基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展, 在人胃癌細(xì)胞系及胃癌動(dòng)物模型中過表達(dá), IRX1 基因可抑制胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、死亡、侵襲、遷移及小鼠皮下成瘤能力［5］。余爽等［6］研究中發(fā)現(xiàn)HCC組織中IRX2的表達(dá)水平低于癌旁組織, IRX2的異常表達(dá)與HCC的分化程度有關(guān)。大量研究表明, IRX基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義［7-10］。

為探討IRX1、IRX2基因在HCC組織細(xì)胞中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞的免疫保護(hù)作用, 本次研究將60例HCC手術(shù)新鮮標(biāo)本作為研究對象, 結(jié)果顯示, 原發(fā)性肝癌組織細(xì)胞中IRX1的mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織, IRX2mRNA表達(dá)量明顯低于癌旁組織, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IRX1與IRX2在肝癌組織中的陽性表達(dá)例數(shù)顯著多于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；IRX1基因表達(dá)程度與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān), IRX2基因表達(dá)程度與腫瘤分化程度呈正相關(guān)。IRX1高表達(dá)組37例, IRX1正常表達(dá)組14例, IRX2高表達(dá)組24例, IRX2正常表達(dá)組27例。MTT檢測后IRX1高表達(dá)組A490顯著低于IRX1正常表達(dá)組, IRX2高表達(dá)組A490顯著高于IRX2正常表達(dá)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明IRX1高表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞增殖, IRX2高表達(dá)會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。IRX1高表達(dá)組細(xì)胞凋亡總比例顯著高于IRX1正常表達(dá)組, IRX2高表達(dá)組細(xì)胞凋亡總比例顯著低于IRX2正常表達(dá)組。表明IRX1高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡, 而IRX2高表達(dá)會(huì)減緩癌細(xì)胞凋亡。IRX1高表達(dá)組G0/G1、G2/M期顯著低于IRX1正常表達(dá)組, S期顯著高于IRX1正常表達(dá)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；IRX2高表達(dá)組G0/G1、G2/M期顯著高于IRX2正常表達(dá)組, S期顯著低于IRX2正常表達(dá)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明IRX1高表達(dá)會(huì)使癌細(xì)胞G0/G1、G2/M期阻滯, S期延長, 提示癌細(xì)胞周期進(jìn)程減緩, 生殖受到抑制；IRX1高表達(dá)會(huì)使癌細(xì)胞G0/G1、G2/M期延長, S期阻滯, 提示癌細(xì)胞周期進(jìn)程加快, 促進(jìn)生殖。

綜上所述, IRX1基因表達(dá)程度與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān), IRX2基因表達(dá)程度與腫瘤分化程度呈正相關(guān)；IRX1基因高表達(dá)能夠抑制癌細(xì)胞生長增殖, 促進(jìn)其凋亡, IRX2基因高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞生長增殖, 減緩其凋亡；兩者均是肝癌細(xì)胞發(fā)展變化的重要指標(biāo)。但本研究尚未探究清楚IRX1、IRX2基因抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡、介導(dǎo)周期停滯機(jī)制,還需進(jìn)行更加深入的研究。

［1］ Zhao R, Wu Y, Wang T, et al.Elevated Src expression associated with hepatocellular carcinoma metastasis in northern Chinese patients.Oncol Lett, 2015 , 10(5):3026-3034.

［2］ 周薇, 趙龍鳳, 徐恩偉.同源盒基因家族與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展.中國藥物與臨床, 2016, 16(4):532-535.

［3］ 張鵬幸, 曾偉濤, 劉輝, 等.易洛魁家族同源盒基因IRX1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2017, 17(7):1229-1232.

［4］ Rapidis AD, Wolf GT.Immunotherapy of head and neck cancer:current and future considerations.Journal of Oncology, 2009,2009(3):346345.

［5］ Guo X, Liu W, Pan Y, et al.Homeobox gene IRX1 is a tumor suppressor gene in gastric carcinoma.Oncogene, 2010, 29(27):3908.

［6］ 余爽, 王靜, 董冰, 等.IRX2基因在原發(fā)性肝癌中表達(dá)的初步研究.解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(3):185-189.

［7］ 王斌, 張遜.同源盒基因與腫瘤的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述, 2017,23(7):1329-1333.

［8］ Lu J, Song G, Tang Q, et al.IRX1 hypomethylation promotes osteosarcoma metastasis via induction of CXCL14/NF-κB signaling.Journal of Clinical Investigation, 2015, 125(5):1839.

［9］ 楊惠潔.IRX1基因在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)研究.重慶醫(yī)科大學(xué), 2012.

［10］ 許海濤, 劉良田, 唐永華, 等.同源基因IRX1在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義.中國當(dāng)代醫(yī)藥, 2017, 24(14):4-6.