胡高娃，李 波，徐 飛

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，占原發(fā)性肝癌的70%～90%，在惡性腫瘤中病死率居于第3位，僅次于胃癌和食道癌。90%以上的HCC病例是由慢性肝病發(fā)展而來，而其中最主要的是肝炎肝硬化，約占80%以上[1]。美國肝病研究協(xié)會推薦采用血清學(xué)標(biāo)志物AFP和超聲檢查對肝硬化人群進(jìn)行普查，以提高早期肝癌的檢出率，但AFP對HCC的診斷靈敏度只有39%～65%，僅通過AFP進(jìn)行普查可能會導(dǎo)致漏檢[2]。另外，在許多慢性非惡性腫瘤患者血清中AFP濃度也有升高，采用AFP進(jìn)行HCC篩查也可能導(dǎo)致5%假陽性。早期篩查方法靈敏度不足導(dǎo)致60%以上的HCC患者在晚期才被確診，錯過了治療的最佳時期，這些被晚期確診的HCC患者5年生存率＜16%，早期接受治療的患者5年生存率可達(dá)到75%以上[3]。如果能及時發(fā)現(xiàn)甚至在尚未發(fā)生HCC時對肝硬化患者進(jìn)行預(yù)警，進(jìn)行合適的干預(yù)，可以顯著降低HCC的病死率。目前，AFP和其他HCC血清標(biāo)志物在早期預(yù)警方面的價值尚不明確。

α胰蛋白酶H4重鏈（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4）是分子量為120 kDa的血清糖蛋白，由肝臟分泌至血循液環(huán)中，屬于急性時相反應(yīng)蛋白。ITIH4在功能上主要參與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）成分的分泌和形成調(diào)節(jié)。目前文獻(xiàn)報道，ITIH4可能通過下調(diào)IL-6表達(dá)從而參與HCC的發(fā)生和發(fā)展。IL-6通過與其受體結(jié)合，繼而活化胞內(nèi)一系列信號蛋白分子，最終實現(xiàn)IL-6反應(yīng)基因的表達(dá)。目前認(rèn)為IL-6及其受體介導(dǎo)的信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。在本研究中，通過對病毒性肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者進(jìn)行隨訪，驗證ITIH4作為HCC早期預(yù)警和診斷標(biāo)志物的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 對象 109例患者均為解放軍第三〇二醫(yī)院門診和住院患者，開始研究時間為2013年1月，經(jīng)過2年隨訪，研究結(jié)束時間為2015年12月?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①具有5年以上HBV或HCV感染史；②年齡＞35歲；③臨床明確診斷為肝硬化且排除惡性腫瘤的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥和其他系統(tǒng)性疾??；②接受過與肝病相關(guān)的侵入性治療方案；患者最終診斷通過MRI檢查確認(rèn)，所有患者均簽署知情同意書，由醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。患者經(jīng)過2年的隨訪，觀察患者是否進(jìn)展為HCC，診斷結(jié)果以MRI檢測結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)展為HCC的患者為HCC組，未進(jìn)展為HCC的患者為非HCC組。

1.2 隨訪方案 患者在首次納入本研究后即進(jìn)行血清樣本采集，隨后進(jìn)行隨訪，每隔半年進(jìn)行1次MRI檢查，如確診已進(jìn)展為HCC，則隨訪結(jié)束，并于確診時間點再次采集血清樣本，如2年內(nèi)未進(jìn)展為HCC，則隨訪研究結(jié)束。

1.3 樣本采集 清晨空腹禁水狀態(tài)下抽取肘靜脈血約3～5 ml于帶分離膠的真空采血干燥管， 離心后分離血清備用。

1.4 實驗操作 ITIH4酶聯(lián)免疫吸附試劑購自武漢伊艾博科技有限公司，按試劑使用說明書操作，將試劑平衡至室溫，加樣孔加入樣本100 μl，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔，混勻后，37 ℃孵育120 min，棄去液體，加溶液A100 μl，37 ℃孵育60 min，棄去液體，洗板3次，每孔加溶液B100 μl，37 ℃孵育60 min，洗板5次，加入底物液90 μl，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μl，用酶聯(lián)儀在450 nm波長檢測各孔OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ITIH4濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料呈正態(tài)分布者用±s表示，非正態(tài)分布者用中位數(shù)（最小值，最大值）表示，2組比較用成組t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，發(fā)生HCC前后比較用自身配對t檢驗。用ROC曲線分析ITIH4和AFP對HCC的預(yù)測價值。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 隨訪結(jié)果 2組患者入組時基本情況見表1。109例患者隨訪2年后，共有29例發(fā)展為HCC（腹部MRI增強(qiáng)確診），發(fā)病率為26.6%?；颊吣挲g（53.9±9.7）歲，男66例（60.6%），女43例（39.4%）。103例為HBV感染導(dǎo)致肝硬化（94.5%），見表1。

表1 HCC組與非HCC組基本情況Table 1 Basic data of group HCC and non-HCC group

2.2 ROC曲線分析 HCC組ITIH4水平低于非HCC組（P=0.000），ROC曲線顯示其預(yù)測HCC的AUC為0.726（P=0.000）。HCC組AFP水平高于非HCC組（P=0.021）。AFP預(yù)測HCC的AUC為0.657（P=0.013），小于ITIH4的AUC（P=0.000），見表2和圖1。

從ROC曲線獲得ITIH4預(yù)警HCC的診斷界值為12.27 ng/ml，其靈敏度為40.0%，特異度為93.1%；AFP預(yù)警HCC的診斷界值為4.76 ng/ml，其靈敏度為86.2%，特異度為41.3%。

2.3 17 例患者發(fā)生HCC前后ITIH4和AFP水平變化 將17例發(fā)展為HCC的患者入組時首次檢測血清和確診為HCC時的血清ITIH4和AFP水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者ITIH4水平在發(fā)展為HCC后有所下降（P＜0.05），而AFP變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3 討 論

鑒于AFP的靈敏度（39%～65%）難以滿足臨床需求，而影像學(xué)和病理學(xué)檢查價格昂貴，患者依從性差，所以近年來對HCC新的診斷標(biāo)志物研究成為腫瘤診斷領(lǐng)域的熱點。

在本文的研究中，我們通過2年的隨訪和樣本采集檢測工作，積累了HCC患者完整的序列樣本，對隨訪患者血清進(jìn)行ITIH4濃度檢測，發(fā)現(xiàn)ITIH4在發(fā)展為HCC和未發(fā)展為HCC的肝硬化患者血清中存在顯著差異，提示ITIH4具有潛在的HCC預(yù)警價值。我們同時將ITIH4與臨床常用的AFP進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ITIH4預(yù)警AUC大于AFP，但AFP靈敏度高于ITIH4，而ITIH4的特異度要高于AFP。

ITIH4屬于急性時相反應(yīng)蛋白，是胰蛋白酶抑制物（inter-alpha-trypsin inhibitor, ITI）的一條重鏈。ITI的重鏈包括ITIH1～I(xiàn)TIH5，其中ITIH4基因定位于3號染色體短臂，目前被發(fā)現(xiàn)與多種實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ITIH4主要參與ECM的分泌和形成調(diào)節(jié)。我們在肝硬化患者血清中發(fā)現(xiàn)了該蛋白的高表達(dá)，可能與該蛋白參與ECM形成有關(guān)。ITIH4可能通過下調(diào)IL-6表達(dá)從而參與HCC的發(fā)生和發(fā)展，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，通過與透明質(zhì)酸結(jié)合參與ECM穩(wěn)定形成的過程，該蛋白由肝臟分泌至血液循環(huán)中，通過免疫學(xué)方法可以測量其在血清中的濃度。很多報道證實ITIH4在各種實體腫瘤中的表達(dá)具有差異，有研究發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)觀察大腸腺癌鼠模型血清中的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)血清ITIH4濃度在腫瘤發(fā)生過程中有顯著改變，證實該蛋白具有早期診斷價值[6]。Subbannayya等[7]通過iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)在胃腺癌的患者中，血清ITIH4水平顯著升高。Yang等[8]則通過蛋白質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)ITIH4是乳腺癌的潛在診斷標(biāo)志物。Gangadharan等[9]采用2D電泳技術(shù)對肝纖維患者和正常對照患者血清蛋白質(zhì)成分進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)了在肝纖維化患者血清中ITIH4濃度也顯著升高。Noh等[10]發(fā)現(xiàn)ITIH4水平與HCC患者預(yù)后顯著相關(guān)，其數(shù)據(jù)顯示ITIH4濃度在正常對照、肝硬化和HCC患者血清中濃度存在顯著差異，肝硬化和HCC患者血清濃度高于正常對照，但HCC患者血清濃度也低于肝硬化患者，說明在HCC發(fā)生后，ITIH4表達(dá)可能下調(diào)，但該報道采用的是橫斷面研究，其結(jié)果缺乏說服力。

表2 HCC組和非HCC組血清AFP及ITIH4水平[中位數(shù)（最小值，最大值）, ng/ml]Table 2 Serum AFP and ITIH4 levels in group HCC and non-HCC group [M(min, max), ng/ml]

圖1 ITIH4和AFP預(yù)測HCC的ROC曲線Figure 1 ROC curve of ITIH4 and AFP for predicting HCC

表3 17例患者進(jìn)展為HCC前后體內(nèi)ITIH4和AFP水平[中位數(shù)（最小值，最大值），ng/ml]Table 3 Serum ITIH4 and AFP levels before and after the progression of HCC in 17 patients [M(min, max), ng/ml]

本文采用前瞻性的隨訪研究，觀察了患者在動態(tài)發(fā)展過程中ITIH4血清濃度的變化，進(jìn)一步證實了該蛋白水平在發(fā)展為HCC后會顯著降低，同時對不同結(jié)局的樣本檢測表明，HCC高風(fēng)險的患者中也存在ITIH4低表達(dá)的情況。因此，該蛋白可以作為預(yù)警標(biāo)志物，定期監(jiān)測可以實現(xiàn)HCC的早發(fā)現(xiàn)，對肝硬化患者的預(yù)后也可以起到一定的指導(dǎo)意義。但本研究受樣本量的影響，其結(jié)果存在一定的偏倚，后續(xù)研究須進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行大樣本、多中心和長期的隨訪研究，進(jìn)一步明確ITIH4在HCC早期診斷和預(yù)警中的價值。

[1]Zhang Z, Zhang Y, Wang Y, et al. Alpha-fetoprotein-L3 and Golgi protein 73 may serve as candidate biomarkers for diagnosing alpha-fetoprotein-negative hepatocellular carcinoma［J］. Onco Targets Ther, 2015, 9:123-129.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017 年版）. 傳染病信息，2017，30(3): I-XVII.

[3]Hernandez-Gea V, Turon F, Berzigotti A, et al. Management of small hepatocellular carcinoma in cirrhosis:focus on portal hypertension［J］. World J Gastroenterol, 2013, 19(8):1193-1199.

[4]Tang Y, Kitisin K, Jogunoori W, et al．Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(7):2445-2450．

[5]Bhanumathy CD, Tang Y, Monga SP, et al．Itih-4, a serine protease inhibitor regulated in interleukin-6-dependent liver formation: role in liver development and regeneration［J］. Dev Dyn, 2002, 223(1):59-69．

[6]Ivancic MM, Irving AA, Jonakin KG, et al．The concentrations of EGFR, LRG1, ITIH4, and F5 in serum correlate with the number of colonic adenomas in ApcPirc/+ rats［J］. Cancer Prev Res (Phila),2014, 7(11):1160-1169．

[7]Subbannayya Y, Mir SA, Renuse S, et al. Identification of differentially expressed serum proteins in gastric adenocarcinoma［J］. J Proteomics, 2015, 127(Pt A):80-88．

[8]Yang J, Xiong X, Liu S, et al. Identification of novel serum peptides biomarkers for female breast cancer patients in Western China［J］.Proteomics, 2016 , 16(6):925-934．

[9]Gangadharan B, Antrobus R, Dwek RA, et al． Novel serum biomarker candidates for liver fibrosis in hepatitis C patients［J］.Clin Chem, 2007, 53(10):1792-1799．

[10]Noh CK, Kim SS, Kim DK, et al．Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 as a diagnostic and prognostic indicator in patients with hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Clin Biochem, 2014, 47(13-14):1257-1261．