胡 娜 王 靜

1.山西省中醫(yī)院肝病科 (山西 太原， 030012) 2.山東省威海市榮成市崖西中心衛(wèi)生院

芪苓益肝顆粒由黃芪、茯苓、丹參、甘草等中藥組成，有健脾益氣、疏肝活血等功效，臨床用于治療慢性肝病療效顯著[1～3]。但由于中藥成分的多樣性和作用機(jī)制的多靶點(diǎn)、多通路，目前對(duì)于芪苓益肝顆粒的主要活性成分和潛在的分子作用機(jī)制研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)觀點(diǎn)從系統(tǒng)水平分析藥物作用機(jī)制，闡明分子-靶點(diǎn)-疾病之間的相互關(guān)系，其與中藥整體調(diào)控機(jī)體的理念相吻合[4,5]。JAK-STAT信號(hào)通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程，與諸多慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,7]。筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[8]，研究芪苓益肝顆粒的主要活性成分和JAK-STAT信號(hào)通路介導(dǎo)的分子作用機(jī)制，為芪苓益肝顆粒治療慢性肝病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芪苓益肝顆粒成分收集 從Universal Natural Products Database(UNPD，http://pkuxxj.pku.edu.cn/UNPD)中檢索黃芪、丹參、茯苓、甘草、茵陳蒿和澤瀉等六味藥材，得到967個(gè)小分子化合物，采用Open Babel[9](2.3.2 version，http://openbabel.org)軟件進(jìn)行分子加氫后，選用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)能量閾值設(shè)定為1×10-3J/mol。

圖1 藥材-分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

1.2 分子對(duì)接 肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑。關(guān)于肝纖維化發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究已成為目前的熱點(diǎn)，其中Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT)信號(hào)通路是較新且近年來研究較多的一條，與肝纖維化形成過程密切相關(guān)[6]。因此，筆者利用分子對(duì)接方法對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG，http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)中檢索，確定與上述疾病密切相關(guān)的21個(gè)作用靶點(diǎn)，刪除蛋白復(fù)合物中的水分子、配體、金屬離子或輔因子等。利用Auto Dock[10](4.0 version，http://autodock.scripps.edu)軟件完成分子對(duì)接工作，以靶點(diǎn)蛋白中原配體分子的坐標(biāo)為盒子的中心，將格子的大小設(shè)置為 X，Y，Z：40，40，40?，格點(diǎn)間距為0.375?，每次對(duì)接產(chǎn)生100個(gè)構(gòu)象，其余參數(shù)設(shè)為默認(rèn)。

1.3 藥物-靶點(diǎn)及靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與特征 本研究以靶點(diǎn)蛋白復(fù)合物中配體的對(duì)接打分為閾值，打分高于該閾值的化合物即認(rèn)為具有活性[11]。從分子對(duì)接結(jié)果中選取對(duì)接打分較高的分子-靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)，并將網(wǎng)絡(luò)中小分子投射到相應(yīng)的藥材，獲取藥材-分子-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Cytoscape[12](3.1 version，http://www.cytoscape.org)網(wǎng)絡(luò)分析軟件，構(gòu)建herb-compound-target (H-C-T)網(wǎng)絡(luò)。利用軟件Network Analyzer模塊[13]對(duì)H-C-T進(jìn)行分析，觀察芪苓益肝顆粒中化合物與靶點(diǎn)的該計(jì)量方法作用情況。

2 結(jié)果

2.1 藥材-分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 從分子對(duì)接結(jié)果中獲取636組對(duì)接打分較高(score≥6)的分子-靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)，其中包含326個(gè)分子及21個(gè)靶點(diǎn)蛋白，平均1個(gè)分子靶向12.48個(gè)靶點(diǎn)蛋白，1個(gè)蛋白與30.53個(gè)分子發(fā)生作用，顯示了芪苓益肝顆粒的多成分、多靶點(diǎn)相互作用的特點(diǎn)。將藥材-分子-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析軟件，構(gòu)建芪苓益肝顆粒H-C-T網(wǎng)絡(luò)見圖1，用network analyzer插件分析后得到整體網(wǎng)絡(luò)特征：網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)(Node)數(shù)目為347，網(wǎng)絡(luò)中心度(Network Centralization)為0.248，網(wǎng)絡(luò)密度(Network density)為0.011，最短路徑數(shù)(Shortest paths)為120062。在生物網(wǎng)絡(luò)中，度(degree)和介數(shù)(betweenness)能刻畫各節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度，H-C-T網(wǎng)絡(luò)中部分重要節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)特征值見表1和表2。

從化合物網(wǎng)絡(luò)特征來看，在326個(gè)活性分子中，節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度大于2的有156個(gè)化合物，部分化合物的網(wǎng)絡(luò)特征如表1所示。節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度大于5的化合物主要分布在甘草(12個(gè))、澤瀉(3個(gè))和丹參(1個(gè))。節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度最高的為Glabrolid(UNPD125061)，共作用于8個(gè)靶點(diǎn)蛋白，對(duì)接平均得分為6.791。Glabrolid是一種三萜類化合物，這類化合物多具有抗炎及保肝作用[14]。節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度較高的Xambioona是一種黃酮類化合物，而甘草中黃酮類化合物多具有抗病毒、抗氧化和保肝等藥理作用[15]。有研究表明Xambioona可以靶向糖皮質(zhì)激素受體，通過增加人體對(duì)外部刺激的適應(yīng)能力和增強(qiáng)機(jī)體的抵抗能力來達(dá)到解毒效果[16]。此外，甘草中節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度較高的化合物，如Glyuranolide、Isoglabrolid、21α-Hydroxyisoglabrolide和Liquiriticacid等化合物也多屬于三萜類化合物，推斷三萜類在慢性肝病中JAK-STAT信號(hào)通路介導(dǎo)發(fā)揮了較為重要的作用。

從靶點(diǎn)蛋白的網(wǎng)絡(luò)特征來看，在21個(gè)相關(guān)的潛在靶點(diǎn)中，節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度大于10的有15個(gè)靶點(diǎn)蛋白表2，它們?cè)贘AK-STAT信號(hào)通路中的關(guān)系如圖2所示。JAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶(PTK)，它既能催化與之相連的細(xì)胞因子受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，又能磷酸化多種含特定SH2區(qū)的信號(hào)分子從而使其激活[17]。JAK蛋白家族共包括4個(gè)成員：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它們平均作用于46.5個(gè)化合物，因而推斷芪苓益肝顆粒通過抑制JAK的磷酸化功能，對(duì)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程產(chǎn)生影響。CBP/P300為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,具有內(nèi)在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，通過介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮非常重要的作用。PIM1和BCL2L1都具有凋亡抑制作用[18,19]，抑制它們的活性，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展和有絲分裂，可能是慢性肝病后修復(fù)的重要機(jī)制之一。

表1 C-T網(wǎng)絡(luò)中部分化合物的網(wǎng)絡(luò)特征比較

表2 C-T網(wǎng)絡(luò)中部分靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)特征比較

3 討論

筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了藥物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，藥物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)芪苓益肝顆粒中含有較多的三萜類化合物和黃酮類化合物，這些化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能等藥理作用，同時(shí)芪苓益肝顆粒中的化合物可以和JAK-STAT信號(hào)通路中多個(gè)重要靶點(diǎn)發(fā)生作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展和有絲分裂等環(huán)節(jié)，而這可能是芪苓益肝顆粒治療慢性肝病的主要機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子水平上揭示了芪苓益肝顆粒的主要活性成分和潛在的分子作用機(jī)制，為該品種的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制提升以及作用機(jī)制的探索提供理論依據(jù)。這種將分子計(jì)算、網(wǎng)絡(luò)分析、文本挖掘等方法組合，將為中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析、作用機(jī)理研究提供一種新的研究策略。