陳益耀 陳 軼 何周桃 巫華志

海南省人民醫(yī)院消化內科 (海南 ?？?， 570311)

氧化應激是非酒精性脂肪性肝病的病因中重要的“二次打擊”因素。課題組在前期的研究中發(fā)現，益智仁乙酸乙酯提取物能夠通過抗氧化應激而達到防治非酒精性脂肪肝的作用。鑒于益智仁乙酸乙酯部中含有豐富的原兒茶酸及白楊素，而原兒茶酸及白楊素有抗氧化活性，故在細胞水平觀察原兒茶酸及白楊素對非酒精性脂肪肝細胞模型的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料 細胞株：人正常肝細胞株L02，受贈于湘雅二院中心實驗室。儀器設備：生物安全柜(型號：Sterile 90)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(型號：AR-3100G)；酶聯(lián)檢測儀(型號：DG5031)；倒置相差顯微鏡(型號：Mitutoyo MF)。 藥物及試劑：胎牛血清(四季青)；1640培養(yǎng)基(Hyclone)；青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone)；ALT試劑盒、AST試劑盒、TG試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、4%多聚甲醛固定液均購買自南京建成科技有限公司。白楊素標準品(北京索萊寶生物科技有限公司)。

參照文獻方法提取益智仁中的原兒茶酸：95%乙醇浸泡益智仁粉后提取，經用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集乙酸乙酯部。100～140目硅膠柱層析，同時進行細胞活性實驗，將有活性組分溶解于甲醇，Sephadex LH-20凝膠層析，經甲醇洗脫得到原兒茶酸。

1.2 方法 L02細胞復蘇、培養(yǎng)：將L02細胞凍存管置于預熱的水浴箱，凍存液融化后，將細胞轉移至無菌離心管，加入細胞培養(yǎng)基，吹打、混勻后離心5分鐘。棄去上清液，加培養(yǎng)液輕吹、混勻后接種于培養(yǎng)瓶內，放入培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)進行培養(yǎng)。

細胞傳代：棄去培養(yǎng)液，PBS液沖洗細胞2遍，棄去PBS液，加入0．25%胰蛋白酶消化。顯微鏡觀察細胞胞體收縮、變圓時倒掉胰蛋白酶，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液終止消化，反復吹打，按1：2傳代。

非酒精性脂肪肝細胞模型的建立：6孔板中置入無菌蓋玻片(多聚賴氨酸包被)，接種細胞，培養(yǎng)24h，移除培養(yǎng)液，加入含1μl/ml 20%脂肪乳的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后傳代，再次加入相同的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，進行模型評價。

油紅O染色：①吸掉培養(yǎng)液，每孔加入2ml PBS。②吸掉PBS，加入1ml 4%甲醛固定、孵育30～60分鐘。③吸掉甲醛，滅菌水漂洗細胞。④加入1ml 60%異丙醇孵育5分鐘。⑤吸掉異丙醇，加入1ml 油紅O液孵育5分鐘。⑥吸掉染色液，滅菌水漂洗至背景無色。⑦加入1 ml蘇木素孵育1分鐘。⑧吸掉蘇木素，用滅菌水洗至背景無色。⑨將蓋玻片反扣在滴加80%甘油的載玻片上，指甲油封片。⑩顯微拍照，細胞核染成藍紫色，脂滴染成紅色。

細胞分組：模型誘導成功后，對照組和模型組分別加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，原兒茶酸組加入含10%胎牛血清和1.0μmol/L原兒茶酸的1640培養(yǎng)液，白楊素組加入含10%胎牛血清和20.0μmol/L白楊素的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。

指標檢測：用油紅O染色鏡下觀察細胞內變化。收集細胞上清液檢測AST、ALT 的含量；收集細胞裂解液檢測MDA、GSH-Px、TG含量及SOD的活性。

2 結果

2.1 油紅O染色結果 對照組L02細胞內未見橘紅色脂滴。模型組脂肪乳干預的L02細胞內見大量橘紅色的脂滴，細胞形態(tài)及活力均好。原兒茶酸組及白楊素組脂滴較模型組減少(見插頁彩圖1)。

2.2 肝細胞功能檢測結果 見表1。

表1 原兒茶酸、白楊素對L02細胞AST、ALT、TG、MDA、GSH-Px及SOD的影響

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

原兒茶酸、白楊素均是天然的小分子化合物，廣泛存在于地椒、景天三七、鎖陽、赤芝子等天然藥材的乙酸乙酯提取物中[1～4]。在南藥益智仁中這兩種天然化合物含量豐富[5～7]。益智仁中的原兒茶酸通過抗氧化對損傷的PC12細胞有明顯的保護作用[8]。另一項研究提示原兒茶酸能夠提高帕金森模型大鼠超氧物歧化酶(SOD)活性，降低TNF-α、IL-1β及MDA水平，提示良好的抗氧化應激活性[9]。關于白楊素的研究提示，其能夠緩解胰島素抵抗，抗氧化應激[10]；通過抗氧化應激，對糖尿病大鼠腦損傷有保護作用[11]；它還能夠提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、SOD活性，保護急慢性缺血導致的大鼠腦組織損傷[12]。原兒茶酸及白楊素均可提取自益智仁，并有著很好的抗氧化作用。

氧化應激在非酒精性脂肪肝的發(fā)展中扮演著重要的角色。胰島素抵抗和脂肪代謝失衡引起脂肪酸、甘油三酯在肝細胞中的沉積，出現單純性脂肪肝；在此基礎上氧化應激加重損傷，誘發(fā)非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化[13～16]。本實驗用含有脂肪乳的培養(yǎng)液培養(yǎng)L02細胞，使肝細胞脂質代謝紊亂，油紅O染色提示肝細胞內有大量脂肪滴堆積，細胞裂解液檢查提示TG明顯升高，提示出現肝細胞脂肪變。GSH-Px、SOD是細胞內ROS清除酶的還原底物，是重要的抗氧化劑，當GSH-Px、SOD等未能完全清除ROS時，便出現氧化應激。而丙二醛(MDA)能抑制抗氧化系統(tǒng)，MDA升高說明存在脂質過氧化。模型組GSH-PX及SOD下降、MDA上升提示L02細胞內出現氧化應激及脂質過氧化。而ALT、AST的升高提示肝細胞受損?？梢?，實驗中成功建立非酒精性脂肪肝細胞模型。經原兒茶酸及白楊素干預后，肝細胞內脂肪滴減少，TG下降，ASL、ALT下降，提示兩者對非酒精性脂肪肝細胞模型有著保護作用；而兩者均能夠提高GSH-PX及SOD活性，降低MDA的含量，提示其作用機制是抗氧化應激。