陳益耀 陳 軼 何周桃 巫華志

海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科 (海南 ?？?， 570311)

氧化應(yīng)激是非酒精性脂肪性肝病的病因中重要的“二次打擊”因素。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，益智仁乙酸乙酯提取物能夠通過(guò)抗氧化應(yīng)激而達(dá)到防治非酒精性脂肪肝的作用。鑒于益智仁乙酸乙酯部中含有豐富的原兒茶酸及白楊素，而原兒茶酸及白楊素有抗氧化活性，故在細(xì)胞水平觀察原兒茶酸及白楊素對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞株：人正常肝細(xì)胞株L02，受贈(zèng)于湘雅二院中心實(shí)驗(yàn)室。儀器設(shè)備：生物安全柜(型號(hào)：Sterile 90)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：AR-3100G)；酶聯(lián)檢測(cè)儀(型號(hào)：DG5031)；倒置相差顯微鏡(型號(hào)：Mitutoyo MF)。 藥物及試劑：胎牛血清(四季青)；1640培養(yǎng)基(Hyclone)；青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone)；ALT試劑盒、AST試劑盒、TG試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、4%多聚甲醛固定液均購(gòu)買自南京建成科技有限公司。白楊素標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶生物科技有限公司)。

參照文獻(xiàn)方法提取益智仁中的原兒茶酸：95%乙醇浸泡益智仁粉后提取，經(jīng)用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集乙酸乙酯部。100～140目硅膠柱層析，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，將有活性組分溶解于甲醇，Sephadex LH-20凝膠層析，經(jīng)甲醇洗脫得到原兒茶酸。

1.2 方法 L02細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)：將L02細(xì)胞凍存管置于預(yù)熱的水浴箱，凍存液融化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打、混勻后離心5分鐘。棄去上清液，加培養(yǎng)液輕吹、混勻后接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：棄去培養(yǎng)液，PBS液沖洗細(xì)胞2遍，棄去PBS液，加入0．25%胰蛋白酶消化。顯微鏡觀察細(xì)胞胞體收縮、變圓時(shí)倒掉胰蛋白酶，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打，按1：2傳代。

非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的建立：6孔板中置入無(wú)菌蓋玻片(多聚賴氨酸包被)，接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h，移除培養(yǎng)液，加入含1μl/ml 20%脂肪乳的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后傳代，再次加入相同的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。

油紅O染色：①吸掉培養(yǎng)液，每孔加入2ml PBS。②吸掉PBS，加入1ml 4%甲醛固定、孵育30～60分鐘。③吸掉甲醛，滅菌水漂洗細(xì)胞。④加入1ml 60%異丙醇孵育5分鐘。⑤吸掉異丙醇，加入1ml 油紅O液孵育5分鐘。⑥吸掉染色液，滅菌水漂洗至背景無(wú)色。⑦加入1 ml蘇木素孵育1分鐘。⑧吸掉蘇木素，用滅菌水洗至背景無(wú)色。⑨將蓋玻片反扣在滴加80%甘油的載玻片上，指甲油封片。⑩顯微拍照，細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，脂滴染成紅色。

細(xì)胞分組：模型誘導(dǎo)成功后，對(duì)照組和模型組分別加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，原兒茶酸組加入含10%胎牛血清和1.0μmol/L原兒茶酸的1640培養(yǎng)液，白楊素組加入含10%胎牛血清和20.0μmol/L白楊素的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。

指標(biāo)檢測(cè)：用油紅O染色鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)變化。收集細(xì)胞上清液檢測(cè)AST、ALT 的含量；收集細(xì)胞裂解液檢測(cè)MDA、GSH-Px、TG含量及SOD的活性。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色結(jié)果 對(duì)照組L02細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)橘紅色脂滴。模型組脂肪乳干預(yù)的L02細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)大量橘紅色的脂滴，細(xì)胞形態(tài)及活力均好。原兒茶酸組及白楊素組脂滴較模型組減少(見(jiàn)插頁(yè)彩圖1)。

2.2 肝細(xì)胞功能檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 原兒茶酸、白楊素對(duì)L02細(xì)胞AST、ALT、TG、MDA、GSH-Px及SOD的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

原兒茶酸、白楊素均是天然的小分子化合物，廣泛存在于地椒、景天三七、鎖陽(yáng)、赤芝子等天然藥材的乙酸乙酯提取物中[1～4]。在南藥益智仁中這兩種天然化合物含量豐富[5～7]。益智仁中的原兒茶酸通過(guò)抗氧化對(duì)損傷的PC12細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用[8]。另一項(xiàng)研究提示原兒茶酸能夠提高帕金森模型大鼠超氧物歧化酶(SOD)活性，降低TNF-α、IL-1β及MDA水平，提示良好的抗氧化應(yīng)激活性[9]。關(guān)于白楊素的研究提示，其能夠緩解胰島素抵抗，抗氧化應(yīng)激[10]；通過(guò)抗氧化應(yīng)激，對(duì)糖尿病大鼠腦損傷有保護(hù)作用[11]；它還能夠提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、SOD活性，保護(hù)急慢性缺血導(dǎo)致的大鼠腦組織損傷[12]。原兒茶酸及白楊素均可提取自益智仁，并有著很好的抗氧化作用。

氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪肝的發(fā)展中扮演著重要的角色。胰島素抵抗和脂肪代謝失衡引起脂肪酸、甘油三酯在肝細(xì)胞中的沉積，出現(xiàn)單純性脂肪肝；在此基礎(chǔ)上氧化應(yīng)激加重?fù)p傷，誘發(fā)非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化[13～16]。本實(shí)驗(yàn)用含有脂肪乳的培養(yǎng)液培養(yǎng)L02細(xì)胞，使肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，油紅O染色提示肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪滴堆積，細(xì)胞裂解液檢查提示TG明顯升高，提示出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變。GSH-Px、SOD是細(xì)胞內(nèi)ROS清除酶的還原底物，是重要的抗氧化劑，當(dāng)GSH-Px、SOD等未能完全清除ROS時(shí)，便出現(xiàn)氧化應(yīng)激。而丙二醛(MDA)能抑制抗氧化系統(tǒng)，MDA升高說(shuō)明存在脂質(zhì)過(guò)氧化。模型組GSH-PX及SOD下降、MDA上升提示L02細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化。而ALT、AST的升高提示肝細(xì)胞受損。可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)中成功建立非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型。經(jīng)原兒茶酸及白楊素干預(yù)后，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪滴減少，TG下降，ASL、ALT下降，提示兩者對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型有著保護(hù)作用；而兩者均能夠提高GSH-PX及SOD活性，降低MDA的含量，提示其作用機(jī)制是抗氧化應(yīng)激。