李 燕 王衛(wèi)民 曹 萌 翟倩倩

河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 (河南 新鄉(xiāng)， 453100)

肝癌是一種常見的消化道腫瘤，具有惡性程度高、發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人類健康，目前尚無有效的治療方法[1]。胰島素是一種多功能的蛋白質(zhì)激素，具有刺激DNA合成、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長的作用，其生理作用的發(fā)揮與肝臟、脂肪組織和骨骼肌等靶器官密不可分，中間任何環(huán)節(jié)缺陷均可導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[2]。近些年的研究顯示，胰島素抵抗與肝癌、胰腺癌等腫瘤具有密切聯(lián)系[3，4]。而高胰島素不僅可促進(jìn)惡性腫瘤的生長和演進(jìn)，且使患者預(yù)后差和死亡率增高[5]。胰島素對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性影響還未清楚。與肝細(xì)胞相關(guān)的胰島素信號途徑主要包括MAPK途徑和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑[6]。鑒于此，本研究以不同濃度的胰島素處理人肝癌細(xì)胞系HepG2，檢測細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡情況，并探討其對PI3K途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞系HepG2購自ATCC(美國菌種保藏中心)細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑和儀器 甘精胰島素注射液購自北京賽諾菲安萬特制藥有限公司；CCK8試劑盒購自美國Promega公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自Thermo公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、PI3K、磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶(pAKT)抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋公司；Transwell板購自美國Corning公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek公司；Matrigel膠、流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮罐中的人肝癌HepG2細(xì)胞，置于37℃水浴中快速溶解，轉(zhuǎn)入含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)傳代，傳代后正常培養(yǎng)，取生長至對數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取生長至對數(shù)期的HepG2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，分別換用200 μL含不同終濃度的胰島素(5μIU/mL、10μIU/mL、20μIU/mL、40μIU/mL、80μIU/mL)的RPMI1640完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對照組和陰性對照組，空白對照組只加培養(yǎng)液，無細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)調(diào)零。陰性對照組只加細(xì)胞和培養(yǎng)液。24h后每孔加入10μL CCK8溶液，37℃孵育4h。利用空白對照組調(diào)零，培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，讀取570nm波長各個(gè)孔的光密度值(OD)，以平均光密度值分析細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell法檢測細(xì)胞侵襲。用Matrigel覆蓋Transwell小室的上室，鋪膠時(shí)盡可能保證膠面平整。風(fēng)干待用。取生長至對數(shù)期的HepG2細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，上室中加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入含有80μIU/mL胰島素的RPMI 1640(含10%胎牛血清)的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基400μL，不做干預(yù)為空白對照組。每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用95%乙醇固定10min，結(jié)晶紫染色15min，倒置顯微鏡下(×200)每膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。將生長至對數(shù)期的HepG2細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24h后棄掉培養(yǎng)基，加入含終濃度為80μIU/mL胰島素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，同時(shí)設(shè)置對照組。然后用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒的說明操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9、PI3K、pAKT蛋白表達(dá)檢測 收集經(jīng)80μIU/mL胰島素培養(yǎng)24h的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度?？偟鞍?0μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗滌，孵育一抗(Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9、PI3K、pAKT抗體均按照1∶1000稀釋)，4℃過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，洗滌，室溫孵育1h，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 胰島素對HepG2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的胰島素處理HepG2細(xì)胞24h后，CCK8檢測細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)隨著胰島素濃度的升高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t5=6.450，P5=0.003；t10=8.046，P10=0.001；t20=9.909，P20=0.001；t40=13.091，P40=0.000；t80=13.672，P80=0.000)。其中80μIU/mL胰島素對細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)，選擇作為研究濃度，見表1。

表1 不同濃度胰島素對HepG2細(xì)胞增殖的影響比較

與對照組比較，**P<0.01

2.2 胰島素對HepG2細(xì)胞侵襲的影響 Transwell法檢測各組細(xì)胞的侵襲數(shù)，Western blot檢測侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，胰島素組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高(t=12.156，P=0.000)，MMP-2和MMP-9蛋白均顯著上調(diào)表達(dá)(tMMP-2=17.126，PMMP-2=0.000；tMMP-9=11.272，PMMP-9=0.000)。見圖1，表2。

圖1 胰島素對HepG2細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)圖

()MMP-2MMP-975.9±5.10.129±0.0150.151±0.017162.3±11.2??0.598±0.045??0.416±0.037??

與對照組比較，**P<0.01

2.3 胰島素對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 80μIU/mL胰島素處理HepG2細(xì)胞24h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測Cleaved caspase 3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，胰島素組細(xì)胞凋亡率顯著降低(t=30.028，P=0.000)，Cleaved caspase 3蛋白顯著下調(diào)表達(dá)(t=6.690，P=0.003)。見圖2、3及表3。

表3 兩組細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白的相對表達(dá)量比較

與對照組比較，**P<0.01

圖3 兩組細(xì)胞Cleaved caspase3蛋白表達(dá)圖

2.4 胰島素對PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot檢測胰島素對PI3K/AKT信號通路PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與對照組比較，PI3K、pAKT的蛋白表達(dá)均顯著升高(tPI3K=16.833，PPI3K=0.000；tpAKT=6.825，Pp-AKT=0.002)。見圖4及表4。

圖4 兩組細(xì)胞PI3K、PAKT蛋白表達(dá)圖

PI3KpAKT 0.155±0.0160.042±0.0090.721±0.056??0.098±0.011??

與對照組比較，**P<0.01

3 討論

胰島素是一種多功能的蛋白質(zhì)激素，作為重要的生長因子，除了具有調(diào)節(jié)代謝外，還能刺激骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等眾多細(xì)胞的增殖和分化，在腫瘤的發(fā)生中也發(fā)揮重要的作用[7]。研究顯示，2型糖尿病、胰島素血癥等患者多種腫瘤的發(fā)生高于一般人[8]。高胰島素水平患者體內(nèi)腫瘤的侵襲能力更強(qiáng)，且與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期有關(guān)，將胰島素作用于體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的總數(shù)及活力增加，且有時(shí)間和濃度的依賴性[9]；在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，胰島素具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用，且隨著濃度增加，細(xì)胞的凋亡降低[10]；動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的惡性腫瘤發(fā)生概率增高，且腫瘤增多，潛伏期縮短，胰島素水平升高[11]。

本研究以肝癌為研究對象，檢測胰島素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖可隨著胰島素濃度增加上升，細(xì)胞侵襲能力升高，細(xì)胞凋亡率降低。細(xì)胞的侵襲是惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一，也是惡性腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中的危險(xiǎn)階段，是患者死亡的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑是侵襲的基本條件，MMP-2和MMP-9是降低基底膜的主要成分，在腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[12]。有研究顯示，在肝癌細(xì)胞中抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)可降低癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力[13]。本研究結(jié)果顯示，胰島素可上調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，這提示胰島素可通過上調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)，阻滯細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞凋亡是指在特定時(shí)空中發(fā)生的，受機(jī)體嚴(yán)密控制的細(xì)胞自殺現(xiàn)象，受到多種基因的調(diào)控。Caspase 3是Caspase家族的關(guān)鍵成員，在Caspase級聯(lián)反應(yīng)的下游，在受到凋亡刺激后被激活，其活化將使凋亡進(jìn)入不可逆階段[14]。目前已在肝癌、肺癌等多種腫瘤中得到研究[15,16]。本研究的結(jié)果說明胰島素可通過下調(diào)Cleaved caspase 3表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。

PI3K/AKT、ERK1/2信號通路的失調(diào)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[17]。PI3K/AKT是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號通路，PI3K下游有多種效應(yīng)分子，AKT是其直接靶點(diǎn)和最主要的靶酶，AKT磷酸化后，可增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力，參與細(xì)胞的增殖及凋亡過程，可抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用[18,19]。有研究指出，肝癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路的激活可促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程[20]。本研究檢測胰島素對PI3K/AKT信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)胰島素可使PI3K、pAKT的表達(dá)上升。

綜上所述，胰島素可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，抑制細(xì)胞的凋亡，其功能與Cleaved caspase 3、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)及PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)。本研究中僅僅檢測了胰島素對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，其他的生物學(xué)特性還有待研究。此外，不同腫瘤對胰島素的反應(yīng)不盡相同，是否還涉及其他的作用機(jī)制，及體內(nèi)外的效應(yīng)是否一致等問題還需進(jìn)一步的研究。本研究為胰島素對肝癌細(xì)胞的作用研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。