王建民，王培森，唐 冉

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是指因胃腸道功能改變，動力減弱，傳導失常而導致的便秘[1]。流行病學研究顯示，STC是臨床常見的病癥,占便秘發(fā)病率的18%～42%,約占功能性便秘發(fā)病率的45.5%[2]。其發(fā)病機制與腸神經遞質、結腸肽類激素、Cajal間質細胞(Cajal interstitial cells，ICC)等密切相關。ICC是廣泛存在于腸神經系統(tǒng)與平滑肌之間的一類極其特殊的間質細胞[3]，是胃腸道慢波的起搏細胞，對調控腸神經信號傳遞到效應器平滑肌細胞起著重要的作用[4]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是腸神經系統(tǒng)中最重要的抑制性神經遞質之一，能抑制胃腸道平滑肌的運動[5],一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是NO合成過程中唯一的酶，而且NOS表達的增多，也可以持續(xù)性地抑制胃腸道的運動。本研究通過益氣健脾通便方干預STC大鼠模型，進一步探討其對ICC及NO、NOS的影響及其調控腸道運動的作用機制，為益氣健脾通便方治療STC提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性8周齡Wistar大鼠60只，體質量(200±20)g，由安徽省動物實驗中心提供，生產許可證號為SCXK2012(皖)-0020，將其隨機分成正常組，模型組，益氣健脾通便方低、中、高劑量組，莫沙必利組，每組10只。大鼠適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 益氣健脾通便方(白術20 g，黃芪、當歸、炒枳實、黨參各15 g，陳皮、杏仁各10 g，炙甘草6 g)：由安徽省中醫(yī)院中藥房提供，由制劑室代煎成水煎劑，含生藥1.2 g/mL；枸櫞酸莫沙必利片(批號 H19990317)：魯南貝特制藥有限公司；復方地芬諾酯(批號 H41023578)：中孚藥業(yè)有限公司；活性炭：杭州鑫膜實業(yè)有限公司；大鼠NO、NOS試劑盒：上海雙贏生物試劑有限公司；無水乙醇、二甲苯：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸(pH 6.0)抗原修復液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、胎牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)：合肥知恩生物技術有限公司。

1.3 儀器 DHP-360A型電熱恒溫培養(yǎng)箱：山東省菏澤市俊騰電子儀器有限公司；JA-21002型電子精密天平：上海雙旭電子有限公司；脫水機(JJ-12J)、包埋機(JB-P5)：武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)：上海徠卡儀器有限公司；脫色搖床(TSY-B)、渦旋混合器(MX-F)：Servicebio；顯微鏡(XSP-C204)：CIC。

2 方法

2.1 模型復制方法 參照文獻[6]方法，應用復方地芬諾酯混懸液灌胃復制STC大鼠模型,模型組大鼠每日給予復方地芬諾酯混懸液(8 mg/kg)灌胃1次,連續(xù)14 d。正常組大鼠以等容量生理鹽水灌胃。當大鼠出現糞便量少且干時，則STC大鼠模型復制成功，停止復方地芬諾酯灌胃。

2.2 給藥方法 模型復制成功后第2天開始，按大鼠用藥劑量相當于60 kg成人臨床用量的6倍，計算大鼠的給藥劑量。益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠每日分別給予益氣健脾通便方6、12、18 g/kg灌胃；莫沙比利組大鼠給予0.15 mg/mL莫沙比利[1.5 mg/(kg·d)]灌胃；正常組和模型組大鼠分別以等容量生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)灌胃4周。

2.3 觀察指標

2.3.1 大鼠一般情況 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動狀況、毛發(fā)光澤度、大便性狀等。

2.3.2 大鼠糞便粒數及含水率檢測 模型復制前1周，模型復制第2周及治療第1、2、3、4周，每日收集各組大鼠糞便，每晚同一時間段(18:00-20:00)記錄糞便顆粒數，并測定糞便含水率。使用電子精密天平稱量大鼠濕糞質量，記為濕質量，將各組大鼠糞便放入80 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中4 h后再稱質量，記為干質量。糞便含水率為糞便濕質量與糞便干質量的差值占糞便濕質量的百分比[7]。

2.3.3 大鼠腸道傳輸功能檢測 末次灌胃結束后，大鼠禁食不禁水24 h，用活性炭混懸液按4 mL/kg灌胃30 min后，將大鼠以頸椎脫臼法處死，隨后剖腹，摘出從幽門下端至直腸末端的腸道，測量摘出腸道的長度及活性炭混懸液在腸道內的推進長度，并計算推進長度占摘出腸道長度的百分比[8]。

2.3.4 大鼠NO、NOS含量的檢測 末次灌胃結束后，每組大鼠禁食不禁水24 h后，按150 mg/kg劑量給予5%水合氯醛腹腔注射麻醉，從腹腔下靜脈抽取5 mL血液，4 ℃靜置2 h以上，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，放至EP管中，封口，置-80 ℃冰箱中保存。按照比色法檢測血漿NO、NOS含量。

2.3.5 大鼠結腸組織ICC檢測 將大鼠麻醉后，取結腸組織，用生理鹽水沖洗后置于10%中性甲醛溶液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，石蠟切片脫蠟至水；將切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，冷卻后用PBS(pH 7.4)洗滌3次；采用3%雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗滌3次；在免疫組織化學圈內滴加3% BSA均勻覆蓋組織，血清封閉；滴加一抗，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育50 min；PBS洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，脫水封片；顯微鏡下檢測，采用圖像采集系統(tǒng)ImagePro-Plus 6.0進行分析，每個標本隨機選取5個高倍視野(10×20倍)。以陽性細胞面積反映ICC表達量。

3 結果

3.1 大鼠糞便形態(tài) 正常組大鼠精神活潑，運動靈活，毛發(fā)光亮，進食、飲水正常，糞便顆粒大小、濕度正常；STC模型大鼠精神萎靡，皮毛無光澤，活動遲鈍，糞便顆粒小而干，進食量減少，無脫肛。結果提示STC大鼠模型復制成功。

3.2 益氣健脾通便方對STC大鼠糞便粒數和含水率的影響 含有一個重復測量變量的兩因素方差分析結果表明，時間因素和處理因素對大鼠糞便粒數和含水率的主效應均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩者的交互作用也均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在模型復制前1周，各組大鼠每日糞便粒數和含水率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型復制第2周，模型組、莫沙必利組及益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠每日平均糞便粒數和含水率均明顯降低，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療第1、2、3、4周，除正常組和模型組外，各治療組大鼠每日平均糞便粒數和含水率均較模型復制前1周有所上升，其中益氣健脾通便方中、高劑量組療效最為顯著。見表1、表2。

3.3 益氣健脾通便方對STC大鼠腸道推進率的影響 與正常組比較，模型組大鼠腸道推進率明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，莫沙必利組與益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠腸道推進率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益氣健脾通便方中、高劑量組較莫沙必利組大鼠腸道推進率有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

3.4 益氣健脾通便方對STC大鼠NO、NOS表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠NO、NOS水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，莫沙必利組與益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠NO、NOS水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益氣健脾通便方高劑量組較莫沙必利組大鼠NO、NOS水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

3.5 益氣健脾通便方對STC大鼠結腸組織ICC的影響 免疫組織化學染色結果顯示，ICC呈現棕黃色或者棕褐色，多位于環(huán)形肌與縱行肌之間，一般以面積代表ICC細胞大小。見圖1。與正常組比較，模型組大鼠結腸組織ICC面積明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，莫沙必利組，益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠結腸組織ICC面積顯著升高(P<0.05)；與莫沙必利組比較，益氣健脾通便方高劑量組大鼠結腸組織ICC面積升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表1 6組大鼠糞便粒數比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與莫沙必利組比較，△P<0.05；與中藥低劑量組比較，◇P<0.05；與模型復制前1周比較，aP<0.05；與治療第1周比較，bP<0.05；中藥指益氣健脾通便方

表2 6組大鼠糞便含水率比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與莫沙必利組比較，△P<0.05；與中藥低劑量組比較，◇P<0.05；與模型復制前1周比較，aP<0.05；與治療第1周比較，bP<0.05；中藥指益氣健脾通便方

表3 6組大鼠腸道推進率比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表4 6組大鼠血漿NO、NOS水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與莫沙必利組比較，△P<0.05

4 討論

STC為臨床上常見的一種功能性腸道疾病，其發(fā)病機制尚不能完全明確，且病情頑固，治療困難。西醫(yī)在治療上多采用促動力藥及瀉藥，但長期服用此類藥物多會產生依賴性，且對腸神經系統(tǒng)、胃腸激素等造成嚴重損害。

注：A.正常組；B.模型組；C.莫沙必利組；D.益氣健脾通便方低劑量組；E.益氣健脾通便方中劑量組；F.益氣健脾通便方高劑量組

圖1 6組大鼠結腸組織ICC表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

STC屬中醫(yī)學“便秘”范疇。古代文獻中對便秘早有諸多記載，如《蘭室秘藏·大便結燥門》謂：“若饑飽失節(jié)，勞役太甚，損傷胃氣，及食辛熱厚味之物，而助火邪，伏于血中，耗散真陰，津液虧少，故大便燥結。”中醫(yī)學認為便秘的病因是多種因素共同構成的，外有寒熱之邪，內有飲食情志失調，或久病體虛，氣血陰陽虧損等。其基本病機責之為臟腑功能失調，大腸傳導失司。

筆者經過幾十年潛心研究，在便秘的診斷治療過程中，全面觀察患者的臨床表現、舌象、脈象，形成了一套以中醫(yī)理論為依據，強調辨證論治的診治體系，注重發(fā)揮中醫(yī)診療特色和優(yōu)勢。便秘的病位在大腸，與肺脾肝腎等臟腑功能失調密切相關，臨床上以脾氣虛導致的便秘最為常見，脾氣虛衰，推動無力，腸道傳導失司，糟粕停聚而發(fā)為本病。對于脾氣虛型便秘，當用益氣健脾、潤腸通便法，擬益氣健脾通便方。方中重用白術為君，意在健脾益氣；黨參健脾益肺，黃芪益中升清，共為臣藥，助君藥行健脾之效；木香行氣導滯，枳實消積化滯，杏仁降氣潤腸，助胃腸氣降，同時佐以當歸、肉蓯蓉溫陽補血、潤腸通便，陳皮理氣健脾，共為佐藥；炙甘草益氣調和。諸藥同用，共奏健脾益氣、潤腸通便之功。本方以補為主，以通為輔，方中大量運用益氣、健脾之藥，如白術、黃芪，使氣旺則大腸推動有力，所謂“寓通于補之中”。中醫(yī)理論認為“肺與大腸相表里”，本方運用黨參補益肺氣，木香、枳實、杏仁降肺通腑，肺氣通調水道，布達津液于大腸，水足舟行，使大腸傳導功能正常發(fā)揮，所謂“從肺治腸”。本方具有寓通于補、肺腸同治的配伍特點。

STC的發(fā)病機制可能與結腸壁內腸神經遞質的異常表達相關。NO作為腸神經系統(tǒng)中最重要的抑制性神經遞質之一，對胃腸道的動力調控具有極其重要的作用[9]。NOS是NO合成過程中唯一的酶，NOS通過催化L-精氨酸生成NO，其活性變化直接影響NO的生成量及其在血液中濃度，而且隨著NOS水平的升高，胃腸道的運動也將受到持續(xù)性抑制[10]。NOS分布廣泛，在胃腸壁全層均有分布，尤以平滑肌最多，NO可通過提高胃腸平滑肌內環(huán)磷酸鳥苷的濃度而導致平滑肌松馳，引起胃腸運動減弱[5]。ICC多位于環(huán)形肌與縱行肌之間，可產生電信號，通過縫隙鏈接傳遞給平滑肌細胞，引起肌層的節(jié)律性收縮，從而激發(fā)胃腸道的運動。ICC對于一些腸神經遞質具有表達性，能合成、放大NO[11]。

本課題通過“復方地芬諾酯灌胃法”復制STC大鼠動物模型，觀察大鼠的糞便粒數、糞便含水率、腸道推進率、NO、NOS含量及結腸組織ICC表達量。研究結果表明，益氣健脾通便方能夠提高STC大鼠糞便粒數、糞便含水率及腸道推進率，同時升高ICC表達量及降低NO、NOS的水平，從而改善便秘癥狀。益氣健脾通便方改善STC的作用機制可能與ICC表達量升高及腸神經遞質NO、NOS受到抑制有關。

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