姬賽賽，王嫻靜，馬晶晶，蔣小燕，袁換云，禹金龍，江 蕓*

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097）

食源性致病菌所致的食源性疾病是我國重要的食品安全問題。大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是引起人類致病的腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. coli，EHEC）最常見的血清型，可引起腹瀉、出血性腸炎和溶血性尿毒綜合癥，后者病死率很高。該菌因感染劑量低、致病力強、危險性大，已經(jīng)成為全球公認的食源性致病菌之一[1-2]。E. coli O157:H7可通過食物、水及接觸進行傳播，其中食源性傳播最為普遍，可通過牛肉、羊肉等動物性食物為主要載體進行傳播[3]。自1982年首次由美國報道了E. coli O157:H7引起的出血性腸炎暴發(fā)，隨后諸多國家包括我國江蘇、安徽等多個地區(qū)均有E. coli O157:H7感染的暴發(fā)流行。

凍藏是食品工業(yè)中常見的貯藏措施，可有效抑制微生物增殖，延長食品貨架期。然而，研究表明凍藏可導致E. coli O157:H7等食源性致病菌產(chǎn)生亞致死損傷[4-6]，損傷菌對選擇性培養(yǎng)基中的一些物質(zhì)敏感而不能生長[7-8]，所以在常規(guī)安全檢測中會被低估或出現(xiàn)假陰性。然而，已有研究表明，損傷菌在一定條件下可以修復為正常狀態(tài)，恢復其致病性等生理特性[9-10]，從而帶來食品安全隱患。

損傷菌修復方面在國內(nèi)外有大量報道，其中較多是關于修復方法的研究，一般采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，或食品（如牛奶、肉）為基質(zhì)以促進損傷菌的修復[9,11-15]，增加檢出率，防止漏檢。但這些研究條件下并未區(qū)分正常菌的增殖和損傷菌的修復，所以若要單獨探討損傷菌的變化情況，則不宜采用營養(yǎng)豐富的基質(zhì)。Koseki等[16]研究發(fā)現(xiàn)超高壓損傷后的E. coli可在無營養(yǎng)的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中修復，本課題組前期研究得到了同樣結論[17]，張勇等[18]亦發(fā)現(xiàn)冷凍24 h的E. coli ATCC25922在PBS中存在一定程度的修復，因此采用PBS作為修復基質(zhì)時，因為不存在正常菌的生長和增殖，從而可以針對性地揭示損傷菌的存活情況。

冷凍食品，如不同種類的肉和肉制品，超市、農(nóng)貿(mào)市場或家庭在不同季節(jié)因環(huán)境溫度不同會自然解凍不同時間。采用不同溫度進行解凍不僅對食品品質(zhì)產(chǎn)生一定影響，對殘存微生物的存活也會產(chǎn)生影響，進而對食品安全和貨架期產(chǎn)生影響。因此，本實驗首先研究E. coli O157:H7不同菌株冷凍后的死亡和損傷情況，進而采用無營養(yǎng)的PBS作為基質(zhì)研究冷凍后不同自然解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響。本實驗摒除了正常菌的增殖，可更加真實地反映殘存菌本身的存活情況，為凍藏食品中食源性致病菌的科學合理的風險評估和有效控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

E. coli O157:H7 CICC21530為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，由南京農(nóng)業(yè)大學國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術研究中心惠贈；E. coli O157:H7 NCTC12900購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2 株分離自牛肉的E. coli O157:H7由南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點實驗室惠贈。4 株菌攜帶毒力基因情況不盡相同[8]。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、山梨醇麥康凱瓊脂（sorbital macconkey ager base，SMAC）、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB） 北京陸橋技術有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SZX超凈工作臺 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司；WGZ-2XJ細菌濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；QL-200微型渦旋混合儀 海門市其林貝爾儀器有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療器械廠；2-16KL高速冷凍離心機 美國Sigma公司；BCD-248T冰箱 河南新飛電器有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將保藏的4 株E. coli O157:H7經(jīng)TSA劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18 h，再轉接至100 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。

1.3.2 冷凍及解凍實驗

1.3.2.1 E. coli O157:H7不同菌株冷凍后存活情況

4 株E. coli O157:H7 TSB活化菌液，用濁度計調(diào)菌液濃度為108CFU/mL（1.005～1.010麥氏濁度單位），然后

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS V17.0進行數(shù)據(jù)分析處理，采用ANOVA進行單因素方差分析中的Duncan’s多重比較檢驗（P＜0.05），數(shù)據(jù)均以 ±s表示。用無菌生理鹽水梯度稀釋菌液至濃度106CFU/mL，并分裝于滅菌的1.5 mL離心管中，分別置于-20 ℃冷凍處理24、48、72 h，采用TSA和SMAC進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，比較不同菌株死亡/凍傷情況，并計算損傷率。

1.3.2.2 冷凍后不同解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響

4 株E. coli O157:H7 TSB活化菌液，4 ℃、6 000×g離心5 min，棄上清液，用滅菌PBS（pH 7.2）離心洗滌3 次，用濁度計調(diào)至濃度為108CFU/mL，無菌生理鹽水梯度稀釋菌液至濃度106CFU/mL，4 株菌的PBS菌液等量混合均勻，分裝于滅菌的1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冷凍處理一定時間，冷凍時間根據(jù)1.3.2.1節(jié)結果確定。進一步進行解凍實驗，1）冷凍后不同解凍溫度對E. coli O157:H7存活的影響：4 株菌的PBS混合菌液冷凍一定時間后，立即取出分別置于20、30、37 ℃解凍12、24、36、48 h，采用TSA進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，觀察不同解凍溫度對E. coli O157:H7存活的影響；2）冷凍后不同緩慢解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響：4 株菌的PBS混合菌液冷凍一定時間后，將冷凍后菌體先置于4 ℃不同時間（0、2、6、12 h）再置于37 ℃不同時間（5、10、30 min），采用TSA和SMAC進行傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，觀察菌株存活情況。上述冷凍及解凍實驗，各處理組均做3個重復。

1.3.3 傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)方法

待測菌液經(jīng)系列10 倍梯度稀釋，選擇3 個合適稀釋梯度，吸取100 μL至TSA或SMAC上，采用平板涂布法，37 ℃培養(yǎng)24 h，對E. coli O157:H7進行菌落計數(shù)。

根據(jù)兩種平板上菌落數(shù)計算損傷率，非選擇培養(yǎng)基TSA上的菌落數(shù)為未損傷、損傷和已繁殖的菌數(shù)，選擇性培養(yǎng)基SMAC上的菌落數(shù)為未損傷、已修復、已繁殖的菌落數(shù)，計算公式如下[19]：

2 結果與分析

2.1 E. coli O157:H7不同菌株冷凍后菌落數(shù)變化

4 株E. coli O157:H7分別置于-20 ℃冷凍處理24、48、72 h，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)，比較不同菌株死亡/凍傷情況。由圖1可知，與冷凍前相比，4 株菌冷凍后兩種培養(yǎng)基TSA和SMAC上的菌落數(shù)均顯著下降（P＜0.05），冷凍時間越長，菌落數(shù)下降越多，表明冷凍導致細菌發(fā)生了死亡和損傷，且冷凍時間越長細菌致死和致傷效果越明顯。進一步比較發(fā)現(xiàn)，冷凍相同時間時，不同菌株菌落數(shù)的下降并不相同，表明冷凍造成細菌死亡和損傷程度存在菌株差異。

圖1 E. coli O157:H7冷凍不同時間后的菌落數(shù)Fig. 1 E. coli O157:H7 counts after freezing for different times

正常菌和損傷菌均能在非選擇性平板TSA上生長，而選擇性平板SMAC上只有正常未損傷菌可以生長，因此非選擇性平板上菌落數(shù)與選擇性平板上菌落數(shù)的差值可以反映損傷菌的數(shù)量。由圖1可知，4 株菌兩種平板上的菌落數(shù)差值（損傷菌數(shù)量）在不同冷凍時間不盡相同，在冷凍72 h時菌株CICC21530、NCTC12900、兩株牛肉分離菌在兩種平板上的菌落數(shù)差值分別為0.91、0.77、0.23、0.52（lg（CFU/mL））。進一步計算4 株E. coli O157:H7冷凍不同時間于活菌中的損傷率，如表1所示，隨著冷凍時間的延長，損傷率逐漸增大，進一步比較不同菌株的損傷率發(fā)現(xiàn)，冷凍過程中4 株菌損傷率不盡相同，冷凍72 h時菌株CICC21530的損傷率最高，達到87.70%。冷凍對微生物的影響與細胞內(nèi)冰晶形成所致的結構損傷有關，還與溶質(zhì)損傷、脫水、氧化脅迫等有關[20-21]，導致細菌發(fā)生可逆性損傷甚至死亡。值得注意的是，由于選擇性培養(yǎng)基SMAC中存在一些抑菌物質(zhì)，所以冷凍前SMAC上的菌落數(shù)稍低于TSA（P＞0.05），即存在一定的損傷率（表1中0 h）。

表1 4 株E. coli O157:H7冷凍不同時間后的損傷率Table 1 Injury rates of four E. coli O157: H7 strains after freezing for different times%

Ro等[22]研究發(fā)現(xiàn)接種于肉制品的EHEC冷凍180 d后菌數(shù)未發(fā)生顯著變化；Metzger等[23]報道接種于奶酪的單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌于-20 ℃冷凍30 d后菌數(shù)未發(fā)生顯著下降，而E. coli O157:H7和傷寒沙門菌則顯著下降；Manios等[6]報道接種于絞碎牛肉中的沙門菌和E. coli O157:H7 -22 ℃冷凍5 d時均發(fā)生了顯著下降，并產(chǎn)生了一定量的損傷菌體，繼續(xù)冷凍至75 d時兩種致病菌數(shù)量未進一步下降。上述研究報道以及本實驗的發(fā)現(xiàn)并不完全一致，主要原因是微生物死亡和損傷程度與冷凍條件、菌液基質(zhì)、菌種、菌株等有關[4-5]。

2.2 冷凍后不同解凍溫度對E. coli O157:H7存活的影響

由2.1節(jié)結果可知，E. coli O157:H7冷凍72 h時產(chǎn)生了較大的損傷和死亡，且存在菌株差異，因此進一步采用混合菌株進行解凍實驗，同時為了避免正常菌增殖的干擾，采用無營養(yǎng)的PBS作為基質(zhì)。4 株菌的PBS混合菌液冷凍前TSA上的初始菌落數(shù)為6.48（lg（CFU/mL）），冷凍72 h后菌落數(shù)顯著下降（P＜0.05）。冷凍后的PBS混合菌液分別置于20、30、37 ℃解凍不同時間，由圖2可知，3 種溫度條件下菌落數(shù)均繼續(xù)下降，且解凍溫度越高下降越明顯，至24 h時3 個解凍溫度組TSA菌落數(shù)均顯著低于冷凍72 h（冷凍后）時菌落數(shù)（P＜0.05），且20 ℃、24 h顯著高于30 ℃、24 h和37 ℃、24 h菌落數(shù)（P＜0.05）。解凍36 h和48 h時，20 ℃和30 ℃菌落數(shù)未再出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），而37 ℃、36 h菌落數(shù)顯著增加（P＜0.05），之后無顯著性變化；至實驗末期48 h時3 個解凍溫度組菌落數(shù)均顯著低于冷凍72 h時菌落數(shù)（P＜0.05）。

圖2 不同解凍溫度條件下E. coli O157:H7存活情況Fig. 2 Survival rates of E. coli O157:H7 thawed at different temperatures

本實驗結果表明，E. coli O157:H7 PBS菌液冷凍后立即置于20、30、37 ℃解凍，細菌發(fā)生了進一步的死亡，解凍溫度越高死亡越明顯。這可能是從-20 ℃立即轉入較高溫度時，菌體無法適應環(huán)境的突然變化而加重了應激損傷程度。但是，張勇等[18]對冷凍24 h的E. coli ATCC25922進行4 h內(nèi)最佳修復方法研究時發(fā)現(xiàn)冷凍后PBS菌液于25 ℃和37 ℃時，發(fā)生了修復甚至菌數(shù)增加，并未發(fā)生進一步的死亡。本實驗與其研究結果不一致，可能與冷凍時間、修復時間、不同菌株等有關。冷凍解凍過程中，細胞內(nèi)相關基因相關蛋白發(fā)生變化，主要的應激蛋白包括熱應激蛋白和冷應激蛋白[24]。黃忠明等[25]將TSB+0.6% YE培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌-18 ℃凍藏90 d后于37 ℃修復，發(fā)現(xiàn)細胞膜相關基因msrR和抗氧化應激相關基因fhuC表達量顯著下調(diào)，而產(chǎn)能代謝相關基因cytB表達量顯著上調(diào)，認為冷凍損傷的金黃色葡萄球菌的修復可能與細胞表面的修復、細胞中活性氧含量降低以及產(chǎn)能代謝活動逐漸增強有關。關于無營養(yǎng)PBS基質(zhì)中細菌的冷凍解凍存活的分子機制值得進一步研究。

采用非選擇性培養(yǎng)基如TSA、TSAYE等進行培養(yǎng)計數(shù)，相當于是一種固體修復方法。早期即有研究表明，最佳修復培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件與應激種類、損傷程度和機制、菌種和菌株等有關[26]。例如，單核細胞性李斯特菌損傷后，采用非選擇性平板TSAYE計數(shù)時30 ℃培養(yǎng)溫度比37 ℃更有利于其鹽、酸損傷的修復；在TSAYE上添加過氧化氫酶、D-葡萄糖有利于其鹽和酸損傷的修復，添加硫酸鎂有利于其熱損傷的修復，而對鹽、酸應激損傷無影響[27-28]。Gurtler等[29]研究發(fā)現(xiàn)TSA平板中添加FeSO4、硫代二丙酸、丙酮酸鈉可增加熱損傷沙門菌的修復。Manios等[6]研究凍傷對沙門菌影響時采用TSA添加1%丙酮酸鹽作為非選擇性計數(shù)培養(yǎng)基以增加損傷菌的修復。PBS作為一種無營養(yǎng)基質(zhì)，損傷菌可以修復而正常菌不出現(xiàn)增殖[16]，本實驗中37 ℃解凍36 h時菌落數(shù)出現(xiàn)增加，可能是解凍初期冷凍損傷嚴重的菌體采用TSA、37 ℃培養(yǎng)計數(shù)時并未得到完全修復生長，至解凍36 h時有更多的修復菌體能夠在TSA、37 ℃條件下生長，從而使菌落數(shù)出現(xiàn)增加，其具體機制尚需進一步研究。本實驗結果表明，冷凍后立即于較高溫度下解凍不利于細菌的存活。為了探討在緩慢解凍時細菌的存活情況，進一步進行冷凍后緩慢解凍方式對E. coli O157:H7存活影響的實驗。

2.3 冷凍后不同緩慢解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響

4 株菌的PBS混合菌液冷凍72 h后先置于4 ℃一定時間（0、2、6、12 h），再置于37 ℃不同時間（5、10、30 min）觀察菌株存活情況，如圖3所示，冷凍前TSA上的初始菌落數(shù)為6.33（lg（CFU/mL））。冷凍后于4 ℃解凍0、2、6、12 h再置于37 ℃，與冷凍前相比兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)均顯著低于冷凍前（P＜0.05），僅除了4 ℃、12 h/37 ℃、5 min組TSA上的菌落數(shù)（P＞0.05），表明緩慢解凍仍造成了一定量細菌的死亡/損傷。4 ℃放置一定時間后，置于37 ℃、5 min，37 ℃、10 min，37 ℃、30 min各組兩種平板上的菌落數(shù)均稍有下降，顯著性分析具體結果見圖3。

圖3 不同緩慢解凍方式條件下E. coli O157:H7存活情況Fig. 3 Survival rates of E. coli O157:H7 treated by different slow thawing methods

進一步對37 ℃、5 min的各組進行比較時發(fā)現(xiàn)，4 ℃條件下時間越長菌數(shù)越多，4 ℃ 0 h和2 h之間菌落數(shù)無顯著差異，而4 ℃ 6 h和12 h菌落數(shù)顯著高于4 ℃ 0 h和2 h（P＜0.05）。37 ℃、10 min各組和37 ℃、30 min各組亦存在相似變化趨勢。結果表明4 ℃緩慢解凍時間越長，越有利于細菌的存活。分析原因可能是4 ℃放置較短時間后轉入37 ℃時，菌體無法適應溫度的突然變化而加重應激損傷程度造成了進一步的死亡，當4 ℃放置較長時間后轉入37 ℃時，細菌得到足夠時間的緩沖對較高溫度耐受增強，也可能在4 ℃較長時間時菌體存在一定程度的修復，具體機制有待進一步研究。

Metzger等[23]報道接種于奶酪的單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌-20 ℃冷凍30 d后分別采用4 ℃、14 h和20 ℃、4 h進行解凍，結果兩種解凍方式之間菌數(shù)無顯著差異。Manios等[6]報道接種于絞碎牛肉的沙門菌和E. coli O157:H7 -22 ℃冷凍5、75 d后，分別采用冰箱（4 ℃、16 h）、室溫（20 ℃、12 h）、微波22～24 min進行解凍，結果冰箱解凍或微波解凍與解凍前菌數(shù)無顯著性差異，而室溫解凍與解凍前菌數(shù)相比兩種菌均有所增加，且E. coli O157:H7菌數(shù)顯著增加。本實驗采用無營養(yǎng)PBS基質(zhì)的解凍實驗結論不一致，表明解凍對細菌存活的影響與基質(zhì)存在較大關系。

本實驗采用4 ℃、12 h/37 ℃、5～30 min解凍，TSA上菌落數(shù)無顯著差異，SMAC上的亦無顯著性差異，而SMAC上的菌落數(shù)顯著低于TSA上的菌落數(shù)（P＜0.05），表明尚有一定量損傷菌存在。本實驗結果提示，食品生產(chǎn)中采用“緩慢解凍”方式，在保證食品品質(zhì)的同時，也有利于食源性致病菌的存活，因此在冷凍食品風險控制時除了常規(guī)檢測外，還應重視損傷菌的檢測，以防漏檢或低估。

3 結 論

本實驗首先研究E. coli O157:H7不同菌株冷凍后的死亡和損傷情況，然后采用無營養(yǎng)的PBS作為基質(zhì)研究冷凍后不同解凍方式對E. coli O157:H7存活的影響。結論如下：1）實驗的4 株E. coli O157:H7冷凍后發(fā)生了一定程度的死亡和損傷，冷凍時間越長細菌致死和致傷程度越明顯，且存在菌株差異，冷凍72 h時菌株CICC21530的損傷率最高。2）采用混合菌株進行解凍實驗，E. coli O157:H7 PBS菌液冷凍后立即于20、30、37 ℃解凍，細菌發(fā)生了進一步的死亡，解凍溫度越高死亡越明顯。3）進一步探討緩慢解凍方式對菌體存活的影響，結果表明4 ℃緩慢解凍時間越長，越有利于細菌的存活，但實驗末期仍有一定量損傷菌存在。本實驗提示冷凍食品風險評估時應重視對殘存菌尤其是損傷菌的檢測和控制。

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