李林海，陳麗丹，肖 斌，孫朝暉

感染性疾病是臨床常見疾病之一，多為細菌、病毒和真菌等病原體及其產(chǎn)物所引起的局部或全身性炎癥或器官功能障礙，具有較大的危害性和較高的病死率。在快速準確地查明病因的基礎上，選擇合理的治療方案，可有效地控制疾病的發(fā)生發(fā)展。但目前，病原體的常規(guī)檢測方法存在陽性率低、周期長、對操作人員的技術水平要求比較高等局限。

宏基因組測序是指對特定環(huán)境樣品中的全部病原體基因組進行高通量測序，該方法能夠快速、準確、高效地獲得整個病原體群體的基因組信息。宏基因組測序不依賴于病原體的分離培養(yǎng)，可以得到環(huán)境中豐度較低甚至是痕量病原體的信息，目前該技術已廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)、食品安全和環(huán)境污染防治等各個領域[1-3]。近年來，宏基因組測序越來越多的應用于醫(yī)學研究及臨床診斷領域，如感染類型診斷、抗性基因的鑒定和傳染病的防控等[4-9]。本文對感染性疾病的現(xiàn)狀、病原體的高通量測序技術概況及宏基因組測序在感染性病原體檢測中的應用進行綜述，旨在進一步揭示宏基因組測序在感染性疾病中的重要作用與應用價值。

1 感染性疾病及實驗診斷現(xiàn)狀

目前，全球感染性疾病的發(fā)病率有所上升，病原體呈現(xiàn)多樣化和復雜化的發(fā)展趨勢。重癥急性呼吸綜合征、新型冠狀病毒感染、新變異型克雅病、H7N9禽流感等新發(fā)感染性疾病不斷出現(xiàn)[9]。而HIV、多重或廣譜耐藥的結核分枝桿菌、沙眼支原體等經(jīng)典感染性疾病病原體又死灰復燃或出現(xiàn)新的致病特征。各種新發(fā)和再發(fā)的感染性疾病、不易發(fā)現(xiàn)的多重感染以及不明病因的發(fā)熱等，都給人類健康帶來了巨大的威脅，因此，臨床上對感染性疾病診斷的準確性和時效性提出了更高的要求。

在感染性疾病領域中，獲得病原體的活體（對于細菌、真菌、病毒而言，主要是培養(yǎng)陽性），是感染性疾病診斷的金標準，但病原體的體外培養(yǎng)耗時普遍較長，操作步驟繁瑣，且絕大多數(shù)病原體不可培養(yǎng)；免疫學方法（如補體結合試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗、免疫熒光法和酶標斑點免疫法等）操作簡單，但由于病原體種類繁多，已研發(fā)的抗原、抗體數(shù)量遠遠不能滿足市場需求；PCR檢測具有極高的靈敏度和特異性，但無法完成高通量篩查，檢出率較低；基因芯片技術只能對已知的病原體基因組進行意向性篩查，而無法檢測新的未知病原體[10]。據(jù)統(tǒng)計，約70%的感染性疾病患者因傳統(tǒng)檢測方法無法確定病原體信息，不能得到及時有效地救治，從而使病情惡化。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測方法，對有效診斷和及時防治感染性疾病具有重要的意義[11]。

2 病原體的高通量測序技術

目前，以感染性疾病病原體為檢測目標的高通量測序技術包括全基因組測序、16s rRNA基因測序和宏基因組測序，不同的方法檢測目的不同。

全基因組測序可以得到病原體的全部基因組序列，能夠更全面地了解病原體的遺傳信息，研究樣品中的功能基因及其在環(huán)境中的作用。但全基因組測序分析費用高、周期長，其檢測效率和實驗步驟決定了該技術更多應用于科學研究和病原體基因組數(shù)據(jù)庫的建立[12]。

16s rRNA測序能夠檢測高度保守的16s核糖體亞基，準確地鑒定已知細菌和發(fā)現(xiàn)新細菌，分析樣品中病原體物種的豐度和分布情況，無須構建文庫，極大地縮減了分析周期及成本。該技術的缺點是無法對不同物種的基因功能進行分析，也不能鑒定和區(qū)分病毒、真菌及寄生蟲等其他病原體。

宏基因組學是以某一特定環(huán)境樣品中的病原體群體基因組為研究對象，以測序分析為研究手段，以病原體多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的病原體研究方法?；诤昊蚪M學的高通量測序可以分析病原體群體基因組成及功能，解讀病原體群體的多樣性與豐度，探求病原體與環(huán)境、宿主之間的關系，挖掘具有應用價值的基因資源，開發(fā)新的病原體活性物質(zhì)。宏基因組測序直接從環(huán)境樣品中提取基因組DNA后進行測序分析，將所測序列與專業(yè)數(shù)據(jù)庫比對，得出樣本中所含物種的信息；通過嚴格的宏基因組拼接，可獲得較長的DNA片段；若測序達到一定的通量，可直接獲得一個或多個病原體基因組草圖；在此基礎上進行功能分析及病原體群落結構和多樣性分析，可更準確地反映病原體生存的真實狀態(tài)。該方法不僅可以避開傳統(tǒng)方法（培養(yǎng)法、血清法和 PCR 法）的局限性，快速地檢測出已知病原體，還可以發(fā)現(xiàn)許多未知病原體，直接分析出樣本中的病原體譜、豐度和分布情況，了解潛在病原體的變化情況，有助于診斷一些不明病原體引發(fā)的感染性疾病。隨著周期短、通量高、成本低的第二代、第三代測序技術的廣泛應用，宏基因組測序方法發(fā)生了巨大的變化[13-16]，在獲得海量的測序數(shù)據(jù)后，能夠快速、全面地分析病原體群落結構，為研究病原體組提供了極大便利?；诤昊蚪M測序的病原體組研究已滲透到各個領域，尤其在科學研究與臨床診斷領域，更是取得了極大發(fā)展。

3 宏基因組測序在感染性病原體檢測中的應用

近年來，隨著病原體的進化與變異，抗生素、激素、免疫抑制劑的大范圍使用及惡性腫瘤、器官移植患者日益增加，許多新發(fā)的感染性問題不斷出現(xiàn)，疑難感染病例也不斷增多，傳統(tǒng)的檢測方法難以滿足當前的臨床需求。隨著高通量測序技術的高速發(fā)展，一系列重要病原體全基因組數(shù)據(jù)被陸續(xù)公布，感染性疾病的病原譜逐個被解開，人們對病原體有了更多的認識，這些都為快速、準確、全面地診斷病原體的宏基因組帶來了新的契機[17-20]。

3.1 宏基因組測序在細菌感染性疾病診斷中的應用 細菌是感染性疾病最常見的病原體之一。培養(yǎng)法是細菌分離的標準方法，但細菌培養(yǎng)時間普遍較長，且許多細菌不易培養(yǎng)，多重感染易被忽視，而針對不明原因發(fā)熱患者的病原體檢測更是臨床診斷的難點。采用宏基因組測序可以避開傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限，直接對樣本基因組進行測序，迅速鑒定樣本中的已知病原體，有效發(fā)現(xiàn)各種未知病原體。菌血癥是ICU患者常見的嚴重感染性疾病，須要對病原體進行快速診斷，從而有針對性地進行抗菌治療。Long等[21]對78例ICU患者的血漿分別進行宏基因組二代測序和血培養(yǎng)，結果顯示，宏基因組二代測序方法的病原體檢出率為30.77%，而血培養(yǎng)法僅為12.82%，表明宏基因組測序在病原體檢測中具有更高的靈敏性。Abril等[22]將1例膿毒癥患者血漿中的游離細菌DNA進行宏基因組測序，24 h內(nèi)便檢測出嗜二氧化碳噬細胞菌（Capnocytophaga canimorsus）基因序列高度富集，并使用16s rRNA測序進行確認，體現(xiàn)出宏基因組技術相對傳統(tǒng)檢測方法具有更高的效率。單核細胞增多性李斯特菌常伴隨EB病毒感染，引起傳染性單核細胞增多癥，也可引發(fā)腦膜炎、菌血癥等，傳統(tǒng)檢測技術在早期很難發(fā)現(xiàn)感染該菌。Yao等[23]對3例臨床疑似單核細胞增多性李斯特菌感染的腦膜炎患者的腦脊液進行細菌培養(yǎng)，結果為單核細胞增多性李斯特菌陰性，而腦脊液宏基因組測序確診為單核細胞增多性李斯特菌感染，這是國際上首次將宏基因組測序技術應用于單核細胞增多性李斯特菌的診斷。Ye等[24]采用宏基因組二代測序方法檢出1例病因不明且常規(guī)抗生素治療無效的白血病患兒為痤瘡丙酸桿菌感染，在進行針對性靶向治療后，患者病情迅速好轉。

感染性疾病常見的病原體還包括支原體、衣原體、真菌和寄生蟲等。宏基因組測序在這些病原體的臨床檢測中同樣發(fā)揮了重要的作用[25-26]。Andersson等[27]用Illumina測序平臺對陰道拭子進行宏基因組測序，發(fā)現(xiàn)了沙眼衣原體的染色體和質(zhì)粒，可見對陰道拭子標本直接測序能夠用于檢測多種細菌的基因組序列。宏基因組測序在寄生蟲診斷方面的研究還比較少，未來潛在的研究方向包括寄生蟲的基因組特征與流行病學的關聯(lián)性，以及寄生蟲對腸道微生態(tài)環(huán)境的影響等。

3.2 宏基因組測序在病毒感染性疾病診斷中的應用 目前，病毒感染的診斷以免疫學檢測為主要方法，PCR檢測等分子診斷方法的應用也較為廣泛，但兩種方法均須預判可能的病毒類型，并且無法檢測未知的病毒。利用宏基因組學檢測病原體時，無須預判病原體的范圍，也不存在靶向測序法中的偏倚性。隨著高通量測序耗時的減少和成本的不斷降低，宏基因組測序在病毒感染診斷等領域同樣有著廣闊的應用前景[28]。Ni等[29]對5例ICU疑難重癥患者的血漿樣本DNA進行宏基因組測序，快速檢出其中含有EB病毒DNA，說明宏基因組測序對于傳統(tǒng)的EB病毒免疫學檢測是一個很好的補充。Piantadosi等[30]報道了1例經(jīng)常接觸蜱、嚙齒動物與蝙蝠的嚴重進行性腦炎患者，利用宏基因組測序技術，在4 d內(nèi)鑒定出該患者感染了罕見的博瓦桑病毒。相對于傳統(tǒng)的血清學檢測方法，該患者的病毒檢出時間提早了4周，說明宏基因組測序可應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)類病毒感染的快速檢測。Guan等[31]對4例疑似中樞神經(jīng)病毒感染患者的腦脊液進行宏基因組測序，均檢出病毒感染，同時用PCR進行了二次驗證，結果與宏基因組測序結果吻合。Somasekar等[32]對204例成年急性肝衰竭患者（17例患者已知為HAV或HBV感染）的血清樣本進行病毒感染分析，通過宏基因組二代測序鑒定出8例新病毒感染病例，同時鑒定出一些之前未被檢測出的多重感染病例，表明宏基因組二代測序能夠較好地檢出低豐度的多重感染病原體。

4 宏基因組測序存在的問題及展望

目前，宏基因組測序技術應用于臨床檢測還存在很多實際問題。①臨床標本數(shù)量多，擺放雜，可能會出現(xiàn)交叉污染而導致假陽性結果或數(shù)據(jù)丟失，特別是細菌感染樣本中可能混有大量白細胞，導致宿主信息干擾讀取的目標序列；病原體數(shù)據(jù)也可能與正常菌群混淆或者相互干擾。目前還沒有建立統(tǒng)一的各類臨床標本宏基因組測序的前處理標準；②高通量測序會產(chǎn)生大批量的數(shù)據(jù)，需要專業(yè)的生物信息團隊進行大數(shù)據(jù)分析，由于許多病原體的基因組數(shù)據(jù)庫并不完善，所以分析的成本和時間目前難以控制；③對于許多感染性疾病，其特征性的病原譜尚不明確，僅獲取患者樣本的病原體信息尚不足以明確致病原因和疾病發(fā)展過程，難以實現(xiàn)精確治療和干預；④尚未開展與常規(guī)檢測方法比對的規(guī)律性研究，檢測的敏感度和特異性需要臨床大數(shù)據(jù)評價及與現(xiàn)有方法的比較；⑤目前大部分的研究和應用是以病原體的定性分析為主，須要進一步擴大數(shù)據(jù)庫規(guī)模，將定性信息轉變?yōu)槎啃畔?，以確保臨床診斷結果的準確性[33-34]。

盡管宏基因組二代測序技術的臨床應用受到廣泛關注，但是距離真正應用于感染性疾病檢測還有許多差距和不足。目前，除了一些一類通用測序試劑和儀器設備，僅有應用于產(chǎn)前篩查的二代測序試劑獲得我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市，而其他研究領域，包括感染性病原體篩查的二代測序應用，仍處于產(chǎn)品的注冊檢測、優(yōu)化、臨床試驗等一系列準備工作階段。2016年5月13日，美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了一項關于二代基因測序器械的指導草案，該草案對使用二代測序儀器檢測感染性疾病病原體及毒力標志物的宏基因組測序驗證進行了規(guī)范化指導。這是目前在該領域應用的二代測序儀器可供參考的信息。此外，針對宏基因測序檢測感染性病原體實驗操作方案及結果評價，目前仍缺乏統(tǒng)一的參考標準。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，采用宏基因組測序技術可以突破傳統(tǒng)檢測方法的局限性。針對難以培養(yǎng)的病原體和不明病因無法預判的感染病患，利用高通量宏基因組測序技術和專業(yè)的病原體數(shù)據(jù)庫，可直接對樣本中的病原體DNA進行檢測，通過軟件分析得出覆蓋齊全、準確可靠的樣本病原體遺傳信息。今后須要進一步推進數(shù)據(jù)庫的建設、罕見病原體基因譜的研究、病原體的機制研究以及宏基因組測序標準化流程的建立等工作。相信未來宏基因組測序技術將會逐步解決感染性病原體鑒定的難題，進一步推動臨床微生物學和感染病學的發(fā)展。

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