唐敬，付強(qiáng)強(qiáng)，陳夢(mèng)青，李春梅，陸家政

( 1 廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；2 廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院)

心肌肥厚是心臟的一種較為有效的代償功能，是心臟為了適應(yīng)各種刺激而產(chǎn)生的心肌細(xì)胞體積增大、重量增加，可加強(qiáng)心肌收縮力，維持正常的心臟功能。心肌肥厚主要發(fā)生在心臟長(zhǎng)期壓力負(fù)荷過重的情況下，但長(zhǎng)期持續(xù)刺激可導(dǎo)致病理性心肌肥厚，肥大的心肌需氧量增加，而冠狀動(dòng)脈的供血量往往不足，導(dǎo)致心肌缺血、心率失常、心肌收縮力減退，進(jìn)而誘發(fā)急性心衰，增加患者猝死幾率[1 ,2]。心房鈉尿肽(ANF)是由心房肌細(xì)胞合成并釋放的肽類激素，可使血管平滑肌舒張和促進(jìn)腎臟排鈉、排水，是目前臨床公認(rèn)的心肌肥厚標(biāo)志物。目前病理性心肌肥厚的形成過程及其具體分子機(jī)制尚不明確。研究[3 ,4]發(fā)現(xiàn)，病理性心肌肥厚的形成與腎上腺素能受體的持續(xù)激動(dòng)密切相關(guān)。去甲腎上腺素(NE)是一種較為強(qiáng)烈的α -腎上腺素能受體激動(dòng)劑，研究發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)期作用于人體可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大[5]，但其具體機(jī)制尚不清楚。氯通道蛋白3(ClC-3)是電壓門控氯通道基因家族成員之一，可維持細(xì)胞容積的穩(wěn)定。ClC-3高表達(dá)于心臟組織，對(duì)于維持心臟正常結(jié)構(gòu)和功能有重要作用。目前關(guān)于但與心肌肥厚形成的關(guān)系尚不明確。2016年6 ～ 12月，我們觀察了NE對(duì)心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞體積的影響，并探討其可能作用機(jī)制，旨在為心肌肥厚的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、細(xì)胞及試劑 NE購自美國(guó)Sigma公司。心肌細(xì)胞株H9c2購于中山大學(xué)，于含1% 雙抗、10% 類胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自Shanghai Ruiyu Biotech Co, Ltd，類胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、購自美國(guó)Gibco公司，胰酶購自美國(guó)Sigma公司，TRIzol試劑購自TaKaRa生物公司，Prime ScriptTMRT Reagent、SYBR PCR Mix購自ToYoBo公司，ClC-3抗體購自美國(guó)Abcam公司，CFXTM系列Real-Time PCR儀購自Bio-Rad公司，Applied Biosystems?2720 Thermal Cycler購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)及NE給予方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞計(jì)數(shù)后種板，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后用PBS清洗3次，換用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別加入終濃度為2 μmol/L的 NE、等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 細(xì)胞體積檢測(cè) 取兩組細(xì)胞，PBS洗3次，0.25%胰酶消化，終止消化后，吹打混勻，通過Countstar自動(dòng)計(jì)數(shù)儀測(cè)量細(xì)胞直徑，每組選3個(gè)視野測(cè)量，可得到細(xì)胞直徑(d)，按球體體積公式V=4/3π(d/2)3計(jì)算細(xì)胞體積，取平均值。

1.4 細(xì)胞ANF mRNA檢測(cè) 采用RealTime-PCR法。取兩組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)TGEM Plus全波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度及純度。用試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增和分析。以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下：ANF上游引物5′-GGAAGTCAACCCGTCTCA-3′；下游引物：5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGAGTAAGAAACCCTGGAC-3′；下游引物：5′-CTGGGATGGAATTGTGAG-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，Plate Read，循環(huán)40次，Melt curve 55 ℃-95 ℃，每隔0.5 s，維持2 s，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min。以2-ΔΔCt代表目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞ClC-3蛋白檢測(cè) 取兩組細(xì)胞，PBS清洗3次，加入固定液室溫固定細(xì)胞15 min，PBS洗滌3次后加入封閉液，室溫下孵育1 h。除去封閉液，加入ClC-3抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜。再除去一抗，PBS洗滌3次后加入二抗，室溫避光孵育1 h，最后除去二抗，加入細(xì)胞核染色劑(DAPI)，染核3 min。用熒光顯微鏡觀察并于相同條件下拍照。圖片用Image Pro Plus軟件分析兩組平均光密度(AOD)值，以AOD值代表ClC-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞體積比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞體積分別為(2446.0±193.3)和(1736.0±265.6)μm3，二者比較，P<0.05。

2.2 細(xì)胞ANF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組ANF mRNA分別為1.63±0.14、1.00±0.13，二者比較，P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞ClC-3的AOD值比較 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞ClC-3的AOD值分別為0.261±0.062、0.660±0.107，二者比較，P<0.05。

3 討論

心肌肥厚是心血管意外事件的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，主要的病理變化表現(xiàn)為心肌重構(gòu)，包括心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖及心臟細(xì)胞外基質(zhì)改建等多方面的改變，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激壓力及細(xì)胞容積的增加，擴(kuò)張心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)而改變細(xì)胞容積穩(wěn)態(tài)平衡及許多細(xì)胞功能[6]，最終會(huì)導(dǎo)致心衰，致使患者死亡。臨床上多種心臟疾病都能觀察到心肌肥厚的發(fā)生，但其發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，兒茶酚胺、遺傳、機(jī)械性因素、神經(jīng)體液因素、細(xì)胞因子、血流動(dòng)力學(xué)等都被認(rèn)為與其有密切關(guān)系。

腎上腺素能受體是一類介導(dǎo)兒茶酚胺作用的受體，有文獻(xiàn)[7 ,8]報(bào)道，腎上腺素能受體的持續(xù)激動(dòng)可直接導(dǎo)致病理性心肌肥厚的形成。NE是交感神經(jīng)系統(tǒng)中較為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成和分泌，主要激動(dòng) α1和α2 受體，心臟中 α1受體大約占腎上腺素受體總數(shù)的10%[8]，對(duì)于維持心臟功能的正常有重要作用。α1受體在心肌肥厚的形成過程中起重要作用。心臟中主要存在 α1A和 α1B兩種亞型，心臟 α1A 過表達(dá)和 α1B過表達(dá)的小鼠都會(huì)直接表現(xiàn)出心肌肥厚[9]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積增大，細(xì)胞表現(xiàn)出肥大反應(yīng)。α1 受體的持續(xù)激動(dòng)會(huì)導(dǎo)致一些胚胎基因的重新表達(dá)，例如ANF、骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白和β-肌球蛋白重鏈等，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NE作用于H9c2細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ANF的mRNA水平明顯高于對(duì)照組。α1 受體調(diào)控的心肌肥厚的機(jī)制目前尚不完全明確，腎上腺素能受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，可能通過其下游PLC、PKC、MAPK和ERK等信號(hào)通路發(fā)揮作用，在 α1 受體激動(dòng)所致細(xì)胞及動(dòng)物心肌肥厚模型中，都能明顯檢測(cè)到上述通路的激活。也有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，α1 受體激動(dòng)所致的心肌肥厚也與多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如GATA-4、STAT3等有關(guān)，GATA4 的磷酸化與 α1 受體激動(dòng)所致的心肌肥厚密切相關(guān)，STAT3過表達(dá)能逆轉(zhuǎn) α1 受體激動(dòng)引起的心肌細(xì)胞肥大。最近有研究發(fā)現(xiàn)，α1 受體通過調(diào)控白細(xì)胞介素6的分泌來調(diào)控心肌肥厚。有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[11]發(fā)現(xiàn)，腺苷酸A1受體激活能改善 α1 受體激動(dòng)所致的心肌肥厚及心肌纖維化。這些研究表明，α1受體在心肌肥厚的發(fā)生過程中有重要作用，但其機(jī)制十分復(fù)雜，尚不完全明確。此外，α1 受體與氯離子的分泌、運(yùn)輸及氯電流的產(chǎn)生密切相關(guān)。在牛視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，α1 受體調(diào)控鉀以及氯的運(yùn)輸，棕脂肪細(xì)胞的 α1 受體持續(xù)激動(dòng)會(huì)激活鈣敏感氯電流。

ClC-3是電壓門控氯通道基因家族成員之一，在包括人類在內(nèi)的許多生物體內(nèi)大量表達(dá)，生物功能多樣，參與了細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡[12 ～ 14]。有研究表明，ClC-3在心臟心房和心室細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等的含量十分豐富，被認(rèn)為是心肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯離子通道(VRCCs)的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15 ,16]。容積調(diào)節(jié)是正常細(xì)胞的基本生理功能，能夠在細(xì)胞微環(huán)境改變時(shí)維持細(xì)胞容積的穩(wěn)定，這對(duì)于細(xì)胞的生存是必不可少的，還可以影響到許多生理病理過程[17]。許多研究從藥理、生物等方面已證實(shí)ClC-3的容積調(diào)節(jié)作用，當(dāng)細(xì)胞容積增大時(shí)，ClC-3通道開放，容積敏感性氯電流(ICl,swell)激活，大量Cl-外流，同時(shí)大量水分外流，細(xì)胞容積恢復(fù)。這對(duì)于心臟缺氧、局部缺血或心肌肥厚導(dǎo)致的心肌細(xì)胞容積改變有很大的保護(hù)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型如心力衰竭犬模型、心力衰竭兔模型、心肌肥厚小鼠模型等發(fā)現(xiàn)ICl,swell的激活[18]。在臨床心肌肥厚患者心肌細(xì)胞中也能檢測(cè)到ICl,swell的激活[19]。這些研究結(jié)果預(yù)示著ICl,swell的激活是心肌細(xì)胞對(duì)于心肌肥厚或心衰導(dǎo)致的心肌重構(gòu)的一個(gè)基本反應(yīng)。最近有研究[20]發(fā)現(xiàn)，特異性敲除成年小鼠心臟的ClC-3基因會(huì)加速心肌肥厚的形成過程，超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，心臟特異性ClC-3基因敲除鼠與正常同年齡的野生鼠相比，前者能夠發(fā)現(xiàn)顯著的心肌肥厚及心力衰竭指標(biāo)。之前亦有研究[21]發(fā)現(xiàn)，在兔心肌細(xì)胞中，發(fā)生心力衰竭時(shí)ICl,swell電流密度減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都預(yù)示了ClC-3在心肌肥厚的形成及維持心臟功能中的重要作用,當(dāng)ClC-3表達(dá)降低時(shí)，ClC-3通道減少，ICl,swell電流密度降低，細(xì)胞容積調(diào)節(jié)能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞體積增大。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ClC-3蛋白水平相對(duì)于對(duì)照組顯著降低，表明ClC-3的降低與NE所致的H9c2細(xì)胞肥大有一定關(guān)系。

綜上所述，NE可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞體積增大，可能與其上調(diào)ANF mRNA表達(dá)、抑制ClC-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

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