譚玉梅 宋革 祝曉麗 鄭煒煒

對男性不可逆的無精子癥、嚴重的少精子癥、弱精子癥、畸精子癥及男方有不宜生育的嚴重遺傳性疾病的治療需行供精人工授精（Artificial Insemination by Donor，AID）或供精體外受精（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer with Donor Semen，D-IVF）胚胎移植輔助生育。在D-IVF中，冷凍精液復蘇后的精液處理非常重要，筆者將采用密度梯度離心聯(lián)合上游法用于冷凍精液的處理，并對處理前后精子的運動參數(shù)進行了分析，同時對處理好的精子受精后對其受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率進行了分析，和同期因丈夫梗阻性無精子采用（Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration，PESA）PESA-ICSI（Intracytoplasmic Sperm Injection）對照組46個周期比較，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 供精組：因為丈夫無精子癥，嚴重少、弱、畸形精子癥，或患有遺傳性疾病不宜生育者，在本院采用供者冷凍精液接受D-IVF治療的135個周期，女方年齡（30.21±3.38）歲，不孕年限（5.43±2.65）年。對照組：2013年1月-2014年7月因丈夫梗阻性無精子采用PESAICSI治療的46個周期，女方年齡（28.87±4.43）歲，不孕年限（4.42±2.58）年。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）

1.2 方法 控制性超排方案：按本院常規(guī)進行[1]。

1.2.1 精子來源及準備 冷凍供精來源于廣東省計劃生育科學研究所精子庫。精液質(zhì)量符合國家衛(wèi)生部要求，供受者血型相符。冷凍精液于37 ℃水浴中解凍10 min，然后進行以下處理：（1）取分裝有1 mL 90%濃度梯度液的一支尖底離心管Ⅰ然后沿管壁緩慢加入1 mL 45%密度梯度液，注意兩者間應形成清晰的界面。做好標記后將液化好的精液用移液管緩緩加1~2 mL于45%密度梯度液之上，注意也應保持其與45%密度梯度液之間的界面清晰，300 g/min離心20 min。精液黏稠度較高或精子密度較低時，可適當延長離心時間。（2）離心結(jié)束后，取另一只尖底離心管Ⅱ并做好標記，然后加入3 mL洗精液，接著用巴斯特吸管將Ⅰ中的沉淀（保留底部0.2~0.3 mL）小心轉(zhuǎn)入Ⅱ中并混勻，再接著200 g/min離心5 min。（3）離心結(jié)束后，棄上清，接著將沉淀團混勻，再接著沿管壁傾斜小心加入適量洗精液，松蓋、傾斜45 °于工作培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃的CO2培養(yǎng)箱）上游1 h。（4）上游結(jié)束后的精子懸液計數(shù)。

1.2.2 IVF授精 計算處理好的精子密度，按照每個卵子周圍10 萬條左右的精子密度進行微滴受精，授精后卵子置于37 ℃，6% CO2培養(yǎng)。

1.2.3 胚胎評分 采用ASEBIR評分系統(tǒng)，D3胚胎，7~8個細胞且大小均勻、碎片<10%、無液泡、透明帶正常者為優(yōu)質(zhì)胚胎[2]。

1.2.4 黃體支持及妊娠 移植14 d后查血、尿HCG呈陽性，第35天行超生檢查見到孕囊并有心管搏動為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 16.5軟件進行分析，計量資料采用（x-±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 處理前后的精子情況比較 冷凍精子復蘇后明顯高于精子優(yōu)選后的密度，冷凍精子復蘇后的活動率和前向運動的百分率明顯低于精子優(yōu)選后的活動率和前向運動的百分比，兩者比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 135個周期冷凍精子復蘇后及將復蘇后的精子進行處理后比較（x-±s）

2.2 兩組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率比較 供精組135個周期共獲得933枚卵子，其中739枚受精成功，2PN卵裂數(shù)為628枚，2PN數(shù)為639枚，2PN優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為420個，臨床妊娠周期數(shù)為75個周期。對照組的46個周期共獲卵452枚，其中成熟卵子數(shù)為385枚，299枚受精成功，2PN卵裂數(shù)為289枚，2PN數(shù)為294枚，2PN優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)為172個，臨床妊娠周期數(shù)為25個周期。兩組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 兩組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率的比較 %

3 討論

隨著輔助技術(shù)的發(fā)展，供精體外受精-胚胎移植（D-IVF）已經(jīng)成為男性不育的一種常規(guī)的治療方法，為許多不孕不育的夫婦解決了生育問題。按照衛(wèi)生部的要求，D-IVF中的精液必須由精子庫提供，人類精子庫提供的冷凍精液具有使用方便、避免感染病毒的優(yōu)點，已在臨床上得到廣泛應用。本院自1985年開展人工授精技術(shù)，1991年開始對精子冷凍技術(shù)的研究。精子庫精液按WHO供精者要求及正常精液標準篩選，2001年8月后按國家衛(wèi)生部關(guān)于人類精子庫管理辦法及人類精子庫技術(shù)規(guī)范有關(guān)要求進行，并采用程序冷凍法進行精液冷凍保存，復蘇率與活動率等指標均符合國家有關(guān)規(guī)定，供精IVF組的精液全部采用本院精子庫提供的精液。DNA完整性是目前檢測精子質(zhì)量的主要指標之一，有研究表明精子的低溫冷凍保存對精子DNA不穩(wěn)定和精子超微結(jié)構(gòu)的變化等有影響[3-6]。從本文研究來看，供精組和對照ICSI組在受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學意義，有研究表明精子的冷凍并不完全影響精子的受精能力，本文的研究與此符合[7-9]。冷凍精液在原有的精液成分上加入了冷凍保護劑，將精子從中優(yōu)選出來要選擇合適的精液處理方法。精子優(yōu)選的方法很多，常用的方法是上游法和密度梯度離心法[10-11]。起初，筆者采用上游法處理冷凍精液，但在處理的過程中卻發(fā)現(xiàn)冷凍精液在上游處理后雖然在活動率上有了提高，但在數(shù)量上卻不理想，由于上游法精子要克服重力向上游，而精子經(jīng)過低溫保存后在冷凍復溫過程中可受到一定的損傷，導致能回收到的精子很少；然后筆者改用SpermGrad密度梯度離心法處理，得到的精子在數(shù)量上有了很大的提高，但是活動率卻不理想，鏡檢時發(fā)現(xiàn)很大比例的IM（Immotility，IM）級精子，這部分的精子為什么也通過密度梯度離心而到達了管底？可能是冷凍精子復蘇后，一部分精子本身是原地不動的精子，它們的密度也一樣可以穿透兩層不連續(xù)的梯度液而到達管底，還有一部分精子復蘇后可能活動率本身就不是很好，馬上經(jīng)過離心等處理后成為了不動的精子，它們也同樣穿透兩層不連續(xù)的梯度液而到達管底，這樣導致比較大比例的IM級精子。已有研究證實一定比例的精子的活動力和活動率與精子的生育力明顯相關(guān)，于是在密度梯度離心后經(jīng)過一次洗滌后用0.2~0.5 mL的受精液上游，上游的時間本中心為1 h，關(guān)于上游的時間不能太短，也不能太長，如果太短則沒有充分將活動精子和非活動精子分開，如果太長如將優(yōu)選后的精子在培養(yǎng)液中孵育2.5 h，呈快速直線前向運動的精子有25%自發(fā)發(fā)生頂體反應[12-15]。因此，在實施輔助生育技術(shù)時，盡量縮短精子在體外環(huán)境中的時間，以免精子自發(fā)發(fā)生頂體反應而失去受精能力，本中心使用1 h的上游時間是合適的，而且將上游液體回收后精子的活動率很高，與優(yōu)化處理前也就是復蘇后精子的活動率和前向運動比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

對供精IVF來說，精子還是比較寶貴的，既要充分將活動精子與非活動精子分開又要盡可能多的篩選到活動的精子，密度梯度離心法聯(lián)合上游法達到了這一目的，從而給良好的受精和臨床妊娠情況提供了一定的保障。

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