桑 暢

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國(guó)福建、廣東等南方數(shù)省高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，具有高復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1-2]。臨床上，至少約60% NPC患者在確診時(shí)腫瘤細(xì)胞就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了該類疾病的臨床治療效果不理想，患者預(yù)后差[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)NPC的發(fā)病和病毒、遺傳以及環(huán)境因素影響相關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已證明NPC的發(fā)生與感染EB病毒密切相關(guān)[4]，鼻咽癌患者外周血中存在很多與病毒相關(guān)抗原、 抗體。 EB病毒特異性抗原包括早期抗原(early antigen，EA)、膜抗原(virus capsid antigen，VCA)、衣殼抗原(membbrance antigen，MA)以及EB病毒核抗原(EB virus nuclear antigen，EBNA)。過往檢測(cè)EB病毒殼IgA抗體 (VCA-IgA)或早期抗原IgA抗體(EA-IgA)等EB病毒相關(guān)的特異性抗體等NPC的血清標(biāo)志物來診斷鼻咽癌，然而其具有較高的假陽性，導(dǎo)致診斷的不準(zhǔn)確性[5]。常規(guī)檢測(cè)方法包括免疫熒光、免疫酶法以及ELISA法等，但以上方法操作繁瑣，往往受主觀因素影響，易出現(xiàn)假陽性等問題，不利于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立和快速準(zhǔn)確診出方法的形成[6]。研究表明，真核細(xì)胞翻譯起始因子 4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯過程中扮演重要角色，受其調(diào)節(jié)的cyclin Dl、MMPs、VEGF及成纖維生長(zhǎng)因子等與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移或組織血管生成等相關(guān)蛋白均與腫瘤病理生理過程相關(guān)[7-8]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)eIF4E表達(dá)增加，某些和細(xì)胞增殖、血管的形成及腫瘤發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵蛋白合成顯著上升，說明eIF4E高表達(dá)能夠促進(jìn)某些惡性腫瘤的相關(guān)基因合成，eIF4E在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮極其重要的作用[9]。目前臨床上關(guān)于eIF4E在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其在鼻咽癌診斷的相關(guān)性研究相對(duì)較少。eIF4E可以作為一種新型腫瘤標(biāo)志物與VCA-IgA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)探索新型有效的NPC早期診斷方法具有重要意義[10]。本研究采用ELISA聯(lián)合q-PCR檢測(cè)VCA-IgA及eIF4E在鼻咽癌早期診斷中的意義，為臨床上鼻咽癌的診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院于2012年6月至2016年6月期間收治的NPC患者60例(NPC組)，其中男性41例，女性19例，年齡43～75歲，平均(55.4±11.3)歲。同期收治的鼻腔乳頭狀瘤、纖維瘤、血管瘤及鼻息肉等良性腫瘤患者45例(對(duì)照組)，其中男性29例，女性16例，年齡35～67歲，平均(51.3±12.1)歲。以上患者既往無其他惡性腫瘤病史，且均由X射線、CT及病理學(xué)檢查確診，結(jié)果符合NPC及其他相關(guān)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者組織樣本均在病理學(xué)檢查中由電子鼻咽鏡獲取，切取標(biāo)本前均未接受放療或化療。

1.2 儀器與試劑

EBV抗體定量檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)于德國(guó)IBL 公司，檢測(cè)平臺(tái)為美國(guó)BIO-RAD 680型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀。RNA提取試劑盒及熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(一步法)均由美國(guó)Thermo公司提供，eIF4E上下游引物由上海生物工程股份有限公司合成，檢測(cè)平臺(tái)為ABI 7900型高通量快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。

1.3 血清VCA-IgA水平檢測(cè)

2組患者清晨空腹抽取外周靜脈血，離心分離血清，由我院檢驗(yàn)科行血清VCA-IgA檢測(cè)，所用方法為ELISA 定量檢測(cè)法。過程簡(jiǎn)述如下：①包被：設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照，將抗原用包被稀釋液稀釋至合適濃度，每孔20～200 μL，加抗原100 μL，置37 ℃，4 h后棄去孔中液體；②封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔：用5%小牛血清置37 ℃封閉40 min，并除去各孔中的氣泡，封閉結(jié)束洗滌3遍，每遍3 min，吸干孔內(nèi)液后在吸水紙上拍干；③加入合適的濃度梯度待檢測(cè)樣品：采用1∶50～1∶400的稀釋度進(jìn)行稀釋，保證樣品吸取量超過20 μL，然后將稀釋好的樣品加入反應(yīng)孔中，每孔100 μL，37 ℃，60 min后棄去孔中液體洗滌3次；④加入酶標(biāo)抗體：根據(jù)說明書提供的稀釋度進(jìn)行稀釋37 ℃，30 min，棄去孔中液體，洗滌；⑤加入底物液：選擇TMB-過氧化氫尿素溶液，每孔100 μL，于37 ℃避光放置3-5分鐘，加入終止液顯色；⑥終止反應(yīng)：每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)，于20 min內(nèi)450 nm波長(zhǎng)讀取各檢測(cè)孔的吸光度。應(yīng)用CurveExpert V1.3分析軟件繪制“濃度—吸光度”標(biāo)準(zhǔn)曲線，再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本實(shí)際血清VCA-IgA含量。以試劑盒為參考指標(biāo)，>15 U/ml記為VCA-IgA陽性。

1.4 組織eIF4E mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

各組患者組織樣本勻漿后提取總RNA，利用Thermo Fermentas 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書操作步驟進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，分別將2 μg的RNA、1 μL的Oligo(dT)以及8 μL的DEPC水加PCR管中，小心吹打后用微型離心機(jī)離心、混勻，進(jìn)行整個(gè)操作過程在冰上完成，然后按試劑盒說明書所列方法配制PCR反應(yīng)體系，每組體系加入10 μl RNA模板，總體系為25 μl。eIF4E上下游引物分別為：5’-ACCTACAACCGATAGCTGCTG-3’和 5’-TTCCGATCTGCTTGTACTGCA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度208 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為參比基因，應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算各樣本組織中eIF4E mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組患者VCA-IgA陽性率及eIF4E mRNA水平比較

NPC組和對(duì)照組的血清VCA-IgA陽性率分別為78.3%(47/60)和46.7%(21/45)。分析發(fā)現(xiàn)，與良性對(duì)照組相比，鼻咽癌組患者血清VCA-IgA水平和組織eIF4E mRNA均明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1 2組患者血清VCA-IgA水平和eIF4E mRNA表達(dá)情況

2.2 NPC患者血清VCA-IgA水平和組織eIF4E mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

血清VCA-IgA水平與NPC患者臨床分期、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間無明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。而各病理類型患者癌組織中eIF4E mRNA的表達(dá)水平間均有差異，晚期鼻咽癌患者以及發(fā)生癌細(xì)胞分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中eIF4E mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，但淋巴結(jié)近端與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者間無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 NPC患者血清VCA-IgA水平和組織eIF4E mRNA表達(dá)情況

2.3 2組患者血清VCA-IgA水平與組織eIF4E mRNA表達(dá)情況相關(guān)性分析

2組患者血清VCA-IgA水平與組織eIF4E mRNA的相關(guān)性分析如表3所示。結(jié)果顯示，良性對(duì)照組患者2種檢測(cè)指標(biāo)間無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而鼻咽癌組以上指標(biāo)間表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)(P<0.01)。

表3 各組患者2種檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討論

在我國(guó)，NPC是常見多發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率位居頭頸惡性腫瘤首位，主要以低分化鱗癌為主[11]。目前NPC的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，由于其早期癥狀復(fù)雜，鼻咽位置隱蔽，早期臨床診出率較低，約60%患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，導(dǎo)致患者的治療預(yù)后差，生存周期短等[12]。常規(guī)的NPC早期篩查多以免疫酶法為主，該方法由鏡下觀察檢測(cè)，結(jié)果判定存在一定的主觀性。常規(guī)病理學(xué)檢查步驟較為繁瑣，且耗時(shí)較長(zhǎng)，臨床上往往因確診需要，達(dá)不到早期診斷的目的[13]。IgA在鼻咽癌中具有高度特異性，因此大多實(shí)驗(yàn)室利用免疫熒光技術(shù)或者酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來檢測(cè)患者血清中的IgA特異性EB抗體，而對(duì)于前期篩查鼻咽癌高危人群也采用VCA-IgA抗體檢測(cè)[14]。研究發(fā)現(xiàn)無論是臨床診斷還是普查追蹤鼻咽癌患者，EB病毒的VCA-IgA抗體均是一個(gè)具有重要意義的標(biāo)志物，然而臨床工作中，90%左右的人VCA-IgA抗體常常處在轉(zhuǎn)陰轉(zhuǎn)陽的波動(dòng)中，僅8.41%的患者VCA-IgA抗體保持原來抗體特征[15]。此外，eIF4E基因是一條長(zhǎng)25 kD位于4q21-4q25可調(diào)控真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯過程的限速蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn)eIF4E基因可在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)過程中發(fā)揮作用的原癌基因 。有研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤患者體內(nèi)均檢測(cè)到eIF4E高表達(dá)，特別是在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中更為明顯； 腫瘤組織中eIF4E的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性及腫瘤轉(zhuǎn)移；此外，eIF4E作為蛋白質(zhì)翻譯調(diào)節(jié)中的重要成分，主要受到cyclin Dl、MMPs等因子調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等腫瘤病理生理過程[16]。因此，eIF4E可以與VCA-IgA聯(lián)合檢測(cè)作為診斷鼻咽癌標(biāo)志物，這對(duì)于NPC早期診斷方法具有重要意義[17]。

本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)VCA-IgA水平采用的是目前應(yīng)用廣泛的ELISA法，結(jié)果判讀明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)手段[18]。從檢測(cè)結(jié)果可以看出，NPC組患者的血清VCA-IgA陽性率為78.3%，且整體平均水平也明顯高于正常標(biāo)準(zhǔn)(15 U/ml)，表明VCA-IgA作為NPC的標(biāo)志物具有顯著的特異性和靈敏性。雖然良性對(duì)照組患者的血清VCA-IgA陽性率明顯低于鼻咽癌組，但其陽性率和整體水平仍明顯高于正常標(biāo)準(zhǔn)。由此看出目前仍存在某些NPC患者的VCA-IgA特異性低以及良性或非腫瘤性疾病可能造成VCA-IgA假陽性等問題，因此單一借助VCA-IgA等標(biāo)志物的早期篩查可能存在一定的局限性。我們前期借助了qPCR方法檢測(cè)了患者組織中的eIF4E mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者組織中eIF4E mRNA表達(dá)水平普遍較高，且整體水平明顯高于對(duì)照組，由此推測(cè)NPC患者組織中eIF4E的表達(dá)具有顯著性差異。我們也應(yīng)用了Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析了2組間血清VCA-IgA水平和eIF4E mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上指標(biāo)在對(duì)照組中無明顯相關(guān)性，而在NPC組中表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)。

綜上所述，VCA-IgV作為NPC的特異性標(biāo)志物在良性患者中存在一定的假陽性，但結(jié)合組織eIF4E表達(dá)差異，可進(jìn)一步提高NPC的診出率，因此VCA-IgA聯(lián)合eIF4E檢測(cè)可能在NPC的早期診斷中具有重要應(yīng)用價(jià)值，值得臨床推廣使用。

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