樂 靜 趙 濤 劉愛林

胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasm，GEP-NEN)是起源于消化道彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一組異質(zhì)性腫瘤群，顯示了從緩慢生長、低度惡性，直至高轉(zhuǎn)移性等惡性生物學(xué)行為[1]。Akt稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種在進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在胞質(zhì)中，是PI3K下游分子[2]。mTOR(mammalian target of rapamycin)是Akt信號(hào)分子下游雷帕霉素作用的靶點(diǎn)，可通過直接磷酸化或抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2形成復(fù)合物激活mTOR信號(hào)[3]。本研究選取在我院住院的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，分析Akt/mTOR信號(hào)通路的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取自2010年1月至2016年1 月在我院經(jīng)病理證實(shí)的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤60例作為實(shí)驗(yàn)組，包括男性35例，女性25例，年齡35～60歲，平均年齡(51.2±2.3)歲；20例患者腫塊位于胃，18例患者腫塊位于小腸，13例患者位于結(jié)腸，11例位于胰腺。同時(shí)取瘤旁組織60例。正常對照組30例，年齡31～70歲，平均年齡(54.2±4.5)歲，均取自于胃腸胰腺炎癥的患者。所有入組患者術(shù)前均未接受過放療、化療、免疫等抗腫瘤治療。患者在性別、年齡等方面無明顯差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

Na2EDTA抗凝劑；Akt ELISA試劑盒；mTOR ELISA試劑盒；Akt封閉液+一抗，mTOR封閉液+一抗，兔抗鼠免疫組化二抗試劑盒；離心機(jī)(上海飛鴿)；顯微鏡(日本Olympus)；酶標(biāo)儀(英國TECNA)；脫水機(jī)(日本TIYODA)；切片機(jī)(德國Leica)；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(美國惠普)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 ELISA法檢測入組患者血液中Akt、mTOR水平 入組患者抽取空腹靜脈血，1500 r/min離心10 min后吸取上清，保存于低溫冰箱中。計(jì)算板孔數(shù)；試劑盒常溫放置30 min；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋；每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加樣；配液；洗滌；顯色；終止；酶標(biāo)儀于450 nm的波長處測量吸光值；繪制線性回歸方程，計(jì)算樣品濃度。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測組織中Akt、mTOR的表達(dá) 福爾馬林固定、脫水、透明；包埋、切片；熱修復(fù)；過氧化氫阻斷；正常山羊血清封閉；加一抗50 μl靜置1 h；加二抗50 μl 靜置10 min；顯色、終止；復(fù)染、分化；封片。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) Akt、mTOR陽性結(jié)果判定以細(xì)胞核不染色，胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，染色細(xì)胞數(shù)陰性(-)：≤10%；弱陽性(+)：>10%～25%；陽性(++)：>25%～50%；強(qiáng)陽性(+++)：>50%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用方差分析，以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多因素用Logistic回歸模型，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測入組患者血清中AKt、mTOR含量

抽取入組患者外周靜脈血，檢測血清AKt、mTOR含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組AKt為(1.57±0.12) ng/ml，mTOR為(0.06±0.03)ng/ml，均較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表1。

表1 ELIASA法檢測入組患者血液中AKt、mTOR含量

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測入組患者組織中AKt、mTOR的表達(dá)

對入組患者組織AKt、mTOR的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中AKt出現(xiàn)14例強(qiáng)陽性表達(dá)，30例陽性表達(dá)，陽性率為73.3%，mTOR出現(xiàn)13例強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)，33例陽性表達(dá)(++)，陽性率高達(dá)76.7%，均較瘤旁組織、對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表2。

表2 IHC法檢測入組患者腦組織中AKt、mTOR的表達(dá)

注：*與瘤旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；#與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

2.3 實(shí)驗(yàn)組AKt、mTOR表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

60例患者中，AKt表達(dá)的有44例，mTOR表達(dá)的有48例。對實(shí)驗(yàn)組患者AKt、mTOR表達(dá)水平與性別、年齡、PS評分、腫瘤部位、分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間等臨床病理特征進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKt、mTOR表達(dá)水平與胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、PS評分、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)；低分化、腫瘤直徑>3 cm、腫瘤數(shù)目多個(gè)、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者生存時(shí)間≤5年的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者，AKt、mTOR的表達(dá)較高；見表3。

2.4 實(shí)驗(yàn)組AKt、mTOR表達(dá)水平與臨床病理特征的logistic多因素分析

對單因素分析中的臨床病理特征進(jìn)行l(wèi)ogistic多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間均是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。

3 討論

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一組起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異質(zhì)性腫瘤，據(jù)報(bào)道，胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生率依次為闌尾38%、小腸29%、結(jié)腸13%、胃12%、直腸8%[4-5]。信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的缺陷和異?；罨c腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，Akt/mTOR信號(hào)通道是關(guān)鍵的細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通道之一，在乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等研究中已得到證實(shí)[6]。本研究選取在我院住院的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，分析Akt/mTOR信號(hào)通路的作用及意義。

表4 實(shí)驗(yàn)組AKt、mTOR表達(dá)水平與臨床病理特征的logistic多因素分析

在本研究中，選取病理證實(shí)的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者為實(shí)驗(yàn)組，胃腸胰腺炎癥的患者為對照組，抽取入組患者外周靜脈血，檢測實(shí)驗(yàn)組的血清AKt、mTOR水平均較對照組升高。進(jìn)一步檢測實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織、瘤旁組織及對照組胃、腸、胰腺組織的AKt、mTOR的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中AK、mTOR蛋白表達(dá)的陽性率均高于瘤旁組織、對照組。這提示，在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的血清及組織中均存在AKt、mTOR的高度表達(dá)。Liu運(yùn)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，肝癌細(xì)胞中Akt的表達(dá)明顯升高[7]。Banumathy G 研究表明，PI3K/Akt /mTOR 信號(hào)通路在肝癌發(fā)病過程中被過度激活，mTOR呈高表達(dá)[8]。這與本研究結(jié)果近似。

本研究進(jìn)一步對實(shí)驗(yàn)組患者AKt、mTOR表達(dá)水平與臨床病理特征進(jìn)行比較，AKt、mTOR表達(dá)水平與胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)，與年齡、性別、PS評分、腫瘤部位無關(guān)；分化程度低、腫瘤直徑>3 cm、腫瘤數(shù)目多個(gè)、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間≤5年的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者，AKt、mTOR的表達(dá)升高。在對喉癌的研究中指出，Akt/mTOR 信號(hào)通路被激發(fā)，在喉癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，Akt/mTOR的表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)，Akt/mTOR過度表達(dá)者，惡性程度較高，影響預(yù)后[9]。對惡性膠質(zhì)瘤和橫紋肌肉瘤等組織的研究指出，Akt/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)情況可以作為腫瘤惡性程度的指標(biāo)之一，對患者的預(yù)后也具有相應(yīng)的指導(dǎo)意義[10]。

綜上所述，在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的血清及組織中均存在AKt、mTOR的高度表達(dá)，表達(dá)水平與胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)。臨床上可進(jìn)一步對AKt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行研究，探索其機(jī)制。

[1] 中國胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理專家組.中國胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理學(xué)診斷共識(shí)意見〔J〕.中華病理學(xué)雜志，2011，40(4)：257-262.

[2] 俞 媛，陳曉蓉.PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用〔J〕.臨床肝膽病雜志，2014，30(9)：954-957.

[3] 張丹丹，李慶林.PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與腫瘤〔J〕.安徽醫(yī)藥，2012，16(3)：281-283.

[4] 楊 宏，張翠英.胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診治進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22(18)：2040-2043.

[5] 盛偉琪.胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷的規(guī)范和進(jìn)展〔J〕.中國癌癥雜志，2013，23(6)：401-407.

[6] Martelli AM，Evangelisti C，Chiarini F，et al.The phosphatidylinositol3-kinase/Akt/mTOR signaling network as a therapeutic target inacute myelogenous leukemia patients〔J〕. Oncotarget，2010，1(2)：89-103.

[7] Liu LX.Gene expression profiles of hepatoma cell line HLE〔J〕.World J Gastroenterol，2003，9(4)：683-687.

[8] Banumathy G.Signaling pathways in renal cell carcinoma〔J〕 .Cancer Biol Ther，2010，10(7)：658-664.

[9] 季冬梅，李 進(jìn). 靶向PI3K/Akt/mTOR通路在胃癌中的研究進(jìn)展〔J〕. 腫瘤，2014，34(2)：191-196.

[10] Emanuel FP,Virginia E,Robyn PA，et al.Phosphoprotein pathway mapping：Akt/mammalian target of rapamycin activation is negatively associated with childhood rhabdomyosarcoma survival〔J〕 Cancer Res，2007，67(7)：3431-3440.