張國強(qiáng) 易 娟 趙 璐 程 毅 高順強(qiáng)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050011)

人毛乳頭細(xì)胞(HDPCs)具有一定的毛發(fā)誘導(dǎo)能力〔1〕，對(duì)毛發(fā)生長及周期循環(huán)起到至關(guān)重要的作用。而體外培養(yǎng)的DPCs呈現(xiàn)凝集性生長是其主要生物學(xué)特性之一〔2〕，這可能和細(xì)胞衰老有關(guān)。p21(又名細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子，CDKN1A)是眾多衰老相關(guān)基因之一〔3〕，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的許多過程。本實(shí)驗(yàn)擬以腺病毒rAd5-CDKN1A成功轉(zhuǎn)染DPCs，沉默DPCs中p21基因，確定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率及最佳滴度，以進(jìn)一步研究p21基因?qū)PCs生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑 HDPCs(貨號(hào)：2400，批號(hào)：9640)購自美國ScienCell公司，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCM)培養(yǎng)基(貨號(hào)：7501，批號(hào)11626)購自美國 ScienCell公司，腺病毒rAd5-CDKN1A-1p2 shRNA(批號(hào)：13079)和rAd5-HKshRNA-EGFP(批號(hào)：130725-3)購自武漢淅瑪生物有限公司，兔抗人p21單克隆抗體(貨號(hào)：2990-1，批號(hào):YJ102911CS)購自 EPITOMICS公司，總RNA抽提試劑盒(Trizol)購自Solarbio公司，莫洛尼質(zhì)鼠白血病病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)8213068)及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)8211212)均購自Invitrogen公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2倒置熒光顯微鏡下測定rAd5-CDKN1A對(duì)DPCs轉(zhuǎn)染效率 取對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)較好的DPCs，制成單細(xì)胞懸液后以每孔1×105個(gè)/ml的濃度接種于2個(gè)6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，分別用rAd5-CDKN1A病毒液轉(zhuǎn)染DPCs，感染系數(shù)(MOI)分別為0、25、50、200、500〔4〕,于48 h后熒光顯微鏡下每孔分別隨機(jī)選擇3個(gè)200倍視野計(jì)數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光蛋白(GFP)陽性細(xì)胞數(shù)，并在明場中計(jì)數(shù)該視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染率(轉(zhuǎn)染率=GFP陽性細(xì)胞數(shù)/明場下該視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù))。

1.33-(4,5-二甲基噻噻-2)-2,5二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測不同濃度rAd5-CDKN1A和rAd5-HK下DPCs的增殖效率 取對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的DPCs制成單細(xì)胞懸液，以每孔按1×105個(gè)/ml的濃度接種于96孔板。代細(xì)胞完全貼壁后，按MOI值為0、25、50、100、200、500加入腺病毒，并設(shè)置相應(yīng)MOI值組，其中以完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照，每組設(shè)立6個(gè)平行孔，分別于指定時(shí)間(24、48、72、96、120、144 h)棄去培養(yǎng)液，用MTT的方法進(jìn)行檢測，計(jì)算細(xì)胞增殖效率。

1.4RT-PCR方法檢測rAd5-CDKN1A和rAd5-HK轉(zhuǎn)染DPCs后p21基因的表達(dá) 收集生長良好的DPCs，按MOI=100分別轉(zhuǎn)染rAd5-CDKN1A和rAd5-HK入DPCs，并收集相應(yīng)細(xì)胞提取mRNA，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCT擴(kuò)增，其中p21引物由Invitrogen公司合成，引物A：5'-ATTCAGCATTGTGGGAGGAG-3'，引物B：5'-TGGACTGTTTTCTCTCGGCT-3'，β-actin 引物也由Invitrogen公司合成，引物A：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，引物B：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。于PCR Pχ2Thermal Cycler機(jī)子上設(shè)置循環(huán)程序?yàn)?5℃，30 s；47℃，30 s；72℃，20 s；35個(gè)循環(huán)。之后再以1.5%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測p21基因表達(dá)，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1rAd5-CDKN1A和rAd5-HK對(duì)DPCs的轉(zhuǎn)染效率 DPCs細(xì)胞對(duì)腺病毒較敏感，隨著MOI的增加，染色陽性率也增加。當(dāng)MOI取值為0、25、50、100、200和500時(shí)，轉(zhuǎn)染效率分別為0、(15.2±2.64)%、(44.3±3.95)%、(95.2±1.06)%、(97.5±1.07)%和(98.9±0.67)%。MOI為0、25、50及100組中各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MOI為100、200和500組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MOI為0、25、50和100組顯示腺病毒的轉(zhuǎn)染效率與病毒濃度呈明顯正相關(guān)(r=0.967，P<0.01；Y=0.978 1，X-4.126 7)，然而隨著病毒濃度的進(jìn)一步增加，即MOI值為100、200和500時(shí)，轉(zhuǎn)染效率升高不明顯(r=0.382，P>0.05)。此外，于MOI=200和MOI=500組的視野中，可見小部分細(xì)胞漂浮，且MOI=500組細(xì)胞漂浮較多，見圖1。

圖1 不同MOI值的重組腺病毒rAd5-CDKN1A shRNA轉(zhuǎn)染DPCs GFP的觀察結(jié)果(×200)

2.2rAd5-CDKN1A轉(zhuǎn)染DPCs對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響 隨著腺病毒rAd5-CDKN1A濃度增加，各實(shí)驗(yàn)組與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖逐漸受到抑制，其中，MOI=200及MOI=500組對(duì)DPCs細(xì)胞的增殖抑制效果明顯；而MOI=100組對(duì)DPCs細(xì)胞的增殖促進(jìn)效果顯著(P<0.05)，MOI=25和MOI=50組對(duì)DPCs細(xì)胞增殖無明顯作用，見圖2。

圖2 不同MOI值下DPCs的生長曲線

2.3rAd5-CDKN1A轉(zhuǎn)染DPCs對(duì)細(xì)胞內(nèi)p21基因mRNA表達(dá)的影響 以MOI=100為理想滴度將rAd5-CDKN1A shRNA和rAd5-HK shRNA導(dǎo)入DPCs中，并提取相應(yīng)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析(以正常細(xì)胞為基準(zhǔn)，將轉(zhuǎn)染rAd5-HK shRNA的細(xì)胞作為空載體對(duì)照)。發(fā)現(xiàn)rAd5-CDKN1AshRNA處理后的DPCs中p21基因條帶明顯暗于正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)染rAd5-HK shRNA的細(xì)胞，見圖3。

1：rAd5-CDKN1A shRNA,2:rAd5-HK shRNA,3:正常細(xì)胞圖3 正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染rAd5-HK shRNA和rAd5-CDKN1A shRNA細(xì)胞中P21基因表達(dá)

3 討 論

DPCs位于毛囊基底部，具有毛發(fā)誘導(dǎo)能力，可誘導(dǎo)毛囊形成并在毛發(fā)生長、周期性循環(huán)及再生中發(fā)揮主導(dǎo)作用〔5,6〕。此外，體外培養(yǎng)早期DPCs展現(xiàn)出凝集性生長特性，但體外培養(yǎng)高代次DPCs并不展現(xiàn)這一特性，反而出現(xiàn)生長抑制。有學(xué)者認(rèn)為DPCs凝集性生長特性可能與DPCs的生物學(xué)功能有關(guān)〔7〕。高代次DPCs逐漸喪失凝集性生長特性可能與細(xì)胞衰老有關(guān)。而細(xì)胞衰老是由細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子調(diào)控，其中，細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p21也是一種抑癌基因，其在預(yù)防腫瘤的發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用，并對(duì)細(xì)胞衰老起到一定的調(diào)控作用。

腺病毒主要是通過細(xì)胞表面的特異性受體柯薩奇病毒受體進(jìn)入細(xì)胞，不同類型細(xì)胞對(duì)腺病毒易感性不同，其易感能力取決于細(xì)胞表面作用受體數(shù)目的多少〔4〕。腺病毒早期基因(E1)缺失的腺病毒載體本身沒有復(fù)制能力，但當(dāng)劑量過大或轉(zhuǎn)染時(shí)間過長時(shí)，腺病毒對(duì)感染細(xì)胞卻有一定的毒性〔4〕。這限制了目的基因表達(dá)的時(shí)間和水平，因此，在涉及腺病毒轉(zhuǎn)染的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中，確定最佳MOI便是所有實(shí)驗(yàn)最重要的前提。腺病毒細(xì)胞毒性與MOI感染時(shí)間呈明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系〔4,8〕，尤其是MOI達(dá)到500以上時(shí)，細(xì)胞毒性和目的基因表達(dá)下降都有明顯的表現(xiàn)，但MOI低于50時(shí)，腺病毒對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響〔4,9〕。相關(guān)文獻(xiàn)指出，異常超表達(dá)的p21可引起細(xì)胞生長阻滯，且基因沉默p21大都對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用〔10〕。而另一方面，腺病毒本身對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染過程中，腺病毒的進(jìn)入對(duì)細(xì)胞也是一種外源性刺激，可能引起細(xì)胞一系列的干擾反應(yīng)，使細(xì)胞停滯，生理特性發(fā)生改變?nèi)绮糠旨?xì)胞漂浮等。因此，在腺病毒滴度不合適時(shí)，轉(zhuǎn)染rAd5-CDKN1A對(duì)DPCs的作用可能主要是干擾反應(yīng)，合適滴度的rAd5-CDKN1A才有可能體現(xiàn)出沉默目的基因p21的作用。細(xì)胞部分漂浮可能是由于病毒滴度較大，產(chǎn)生的毒素較多，影響細(xì)胞生長狀態(tài)造成。MTT法繪制轉(zhuǎn)染后DPCs的增殖曲線提示rAd5-CDKN1A對(duì)DPCs的增殖有促進(jìn)作用，符合相關(guān)文獻(xiàn)中p21沉默往往促進(jìn)細(xì)胞增殖的報(bào)道〔10〕?；谙俨《巨D(zhuǎn)染的細(xì)胞毒副作用及促進(jìn)細(xì)胞增殖兩方面考慮，我們選擇MOI=100為rAd5-CDKN1A shRNA轉(zhuǎn)染DPCs的理想滴度。既保證較高的轉(zhuǎn)染效率，又不至于因腺病毒本身對(duì)細(xì)胞毒性作用而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為將來研究p21對(duì)DPCs生物學(xué)特性的影響奠定了基礎(chǔ)。

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