李麗麗，王洪朋，田海偉，李 晉，高雙雙，哈 婧

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，石家莊 050018)

肺動脈高壓是以血管增殖、重塑、原位血栓形成、肺血管床進(jìn)行性閉塞和肺血管阻力進(jìn)行性增加為特征的肺小動脈疾病。Selexipag是由日本新藥株式會社和愛可泰隆醫(yī)藥公司聯(lián)合開發(fā)的一種前列環(huán)素受體(PGI2)激動劑[1]。該藥于2015年12月21日獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，又于2016年5月12日獲歐洲藥品管理局(EMA)批準(zhǔn)上市，用于治療肺動脈高壓。Selexipag化學(xué)名為2-{4-[(5,6-二苯基吡嗪-2-基)(異丙基)氨基]丁氧基}-N-(甲基磺?；?乙酰胺，藥理作用為舒緩血管壁平滑肌從而擴(kuò)張血管，增加肺部供血[2]。Selexipag及其活性代謝產(chǎn)物對IP-受體的選擇性優(yōu)于其他前列腺素受體，被FDA授予孤兒藥地位[3]。其結(jié)構(gòu)式見圖1。

Figure1 Chemical structure of selexipag

Selexipag在合成過程中使用了6種溶劑[4-5]，其中4種第二類溶劑(甲醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯)，2種第三類溶劑(乙醇、丙酮)。目前尚未見有關(guān)selexipag原料藥殘留溶劑的檢測方法報道，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證用藥安全，本研究參考人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)的有機(jī)溶劑殘留量研究指導(dǎo)原則和《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部通則[6]，采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法[7-10]對selexipag原料藥中6種殘留溶劑進(jìn)行測定，建立了selexipag原料藥中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃和甲苯頂空氣相色譜測定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證[11]，結(jié)果表明，該方法分離度好，精密度高、加樣回收率結(jié)果滿意，適用于selexipag原料藥中6種殘留溶劑的測定，并為保證用藥安全，進(jìn)一步控制3類有機(jī)溶劑的殘留量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

Selexipag原料藥為河北省藥用分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，批號分別為20160813、20160911、20160918。其他試劑均為分析純。

1.2 儀 器

GC7900氣相色譜儀(中國天美科學(xué)儀器有限公司)；DK3001A頂空進(jìn)樣器(中國北京中興分析儀器新技術(shù)研究所)；GH-30高純氫發(fā)生器、GA-2000A 低噪音空氣泵(中國北京中興匯利科技發(fā)展有限公司)；AL204萬分之一電子天平(瑞士Mettler公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及測定方法

色譜柱為Kromat PC-624(V)毛細(xì)管柱(固定相為6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷，30.0 m×0.32 mm,1.8 μm)；進(jìn)樣口溫度:200 ℃，檢測器溫度:250 ℃；柱溫：初始溫度為40 ℃，保持5 min，以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持5 min；載氣：高純氮?dú)猓贿M(jìn)樣方式:頂空進(jìn)樣，定量環(huán)1 mL；平衡溫度:80 ℃，平衡時間:30 min；閥箱溫度:100 ℃，傳輸線溫度:110 ℃。

精密量取對照品溶液或供試品溶液5 mL，密封于20 mL頂空瓶中，經(jīng)頂空平衡后，量取其頂端氣體，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積來計算各殘留溶劑的含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 稱取甲醇約1.5 g、無水乙醇約2.5 g、二氯甲烷約0.3 g、四氫呋喃約0.36 g、丙酮約2.5 g、甲苯約0.5 g，精密稱定，各置50 mL量瓶中用二甲基亞砜溶解定容；精密量取上述溶液各1 mL置10 mL量瓶中用二甲基亞砜定容至刻度，作為混合對照品儲備液。精密吸取上述對照品儲備液0.4 mL置10 mL量瓶中用二甲基亞砜定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取selexipag原料藥約0.2 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加入二甲基亞砜5 mL使樣品溶解，搖勻，密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取空白溶劑二甲基亞砜、混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明空白溶劑無干擾，限度混合對照品溶液中各色譜峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，各相鄰峰的分離度大于1.5，色譜圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品儲備液1，3，5，7，10 mL分別置于100 mL量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為系列標(biāo)準(zhǔn)線性溶液，分別精密量取5 mL 置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封，搖勻，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

Figure2 HPLC of blank solution(A)，mixed solvent(B)and selexipag test solution(C)

1：Methanol;2：Ethanol;3：Acetone;4：Dichloromethane;5：Tetrahydrofuran;6：Toluene;7：Dimethy-lsulfoxide

Table1 Results of linearity test for the mixed solvent

SolventLinearequationrLinearrange/(μg/mL)MethanolY=2074X+0041210003207?3201EthanolY=2599X-0065610005010?5010AcetoneY=1698X-361610005164?5164DichloromethaneY=03131X-05616099826080?6076TetrahydrofuranY=2162X-3276099917590?7588TolueneY=1431X-2858099861076?1076

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對照品溶液5.0 mL，分別置于20 mL頂空瓶中，平行制備6份作為精密度試驗(yàn)溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，計算各被測組分甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯峰面積的RSD(%，n=6)，分別為2.9，3.0，3.2，2.4，2.5和3.1，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取selexipag原料藥(批號20160813)約0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)配制供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖按外標(biāo)法進(jìn)行計算。結(jié)果甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯均未被檢出，乙醇的平均含量為0.3%，RSD為2.0%(n=6)，表明系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.7 供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取selexipag原料藥(批號20160813)約0.2 g，按“2.2”項(xiàng)配制供試品溶液5份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，考察樣品溶液8 h之內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯均未被檢出，乙醇的平均含量為0.3%，RSD為1.7%(n=5)，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 檢出限與定量限

取各對照品儲備液，用二甲基亞砜逐級稀釋，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，以信噪比S/N=10為定量限，甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯定量限(μg/mL)分別為16.0，25.15，28.82，3.03，28.45，26.90。以信噪比S/N=3為檢測限(μg/mL)分別為1.60，2.50，2.58，1.51，5.69，5.38。

2.9 定量限精密度試驗(yàn)

分別精密量取甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯定量限溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，計算甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯定量限峰面積的RSD(%，n=3)，分別為2.5，1.9，2.2，3.4，2.8和3.5，表明定量限精密度良好。

2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取對照品儲備液0.32，0.40，0.48 mL置于10 mL量瓶中加入二甲基亞砜定容至刻度。精密稱取20160813批樣品約0.2 g，共9份，分別精密加入上述試液5 mL，每個濃度平行3份，密封、搖勻，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)法進(jìn)行計算，結(jié)果見表2。

2.11 樣品測定

取selexipag原料藥3批(批號分別為20160813、20160911、20160918)，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，每批2份按“2.1”項(xiàng)色譜條件及進(jìn)樣方法進(jìn)行分析，按外標(biāo)法計算3批樣品中乙醇的含量分別為0.3%，0.3%，0.4%，甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯均未被檢出。

Table2 Recovery of six residual solvents of selexipag(n=9)

SolventAveragerecovery/%RSD/%Methanol9967249Ethanol9872324Acetone10167249Dichloromethane9864136Tetrahydrofuran9784146Toluene9857164

3 討 論

3.1 進(jìn)樣方式選擇

Selexipag采取直接進(jìn)樣模式時，甲醇色譜峰拖尾嚴(yán)重，與乙醇分離度較差，而且由于樣品質(zhì)量濃度較大，直接進(jìn)樣易造成色譜柱污染，所以采取頂空進(jìn)樣方式。

3.2 溶劑的選擇

Selexipag水溶性較差，不能用水作溶劑直接進(jìn)樣，N，N-二甲基甲酰胺作溶劑時各溶劑峰之間分離度不理想；而用二甲基亞砜作溶劑時對待測的6種溶劑無干擾回收率好，各溶劑峰形較好，最終選擇二甲基亞砜作為試驗(yàn)溶劑。

3.3 頂空平衡溫度的選擇

固定頂空平衡時間30 min，考察平衡溫度分別為80，90，100 ℃時各待測溶劑的色譜峰面積的變化。隨著平衡溫度的提高，色譜峰面積沒有明顯增高的趨勢，考慮到溫度過高會使藥物分解影響分析結(jié)果，且待測溶劑均可在80 ℃條件下全部檢出，故將平衡溫度設(shè)為80 ℃。

3.4 頂空平衡時間的選擇

固定平衡溫度80 ℃，分別考察平衡時間為20，30，40 min，各待測溶劑的色譜峰面積的變化結(jié)果表明，平衡時間為30和40 min時，待測組分峰面積明顯高于20 min，但30 min和40 min平衡時間測定的待測溶劑峰面積沒有明顯差異，故將平衡時間設(shè)為30 min。

3.5 頂空進(jìn)樣瓶中溶劑體積的選擇

頂空瓶中分別加入溶劑3，4，5 mL，考察峰面積變化情況，結(jié)果表明加入5 mL溶劑時峰面積明顯高于3 mL，4 mL。因考慮到氣液平衡及進(jìn)樣針的位置問題并沒有繼續(xù)考察加大溶劑量的情況，最終選擇5 mL作為進(jìn)樣瓶中的溶劑體積。

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