杜曉典，孫福謀，袁敏訥，王 斐，劉雅利，尚鵬釗，王 旻，張 娟

(中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院抗體工程實驗室，南京 210009)

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展需要新生血管供給營養(yǎng)，大量臨床數(shù)據(jù)證明任何可探測的實體瘤的生長都伴隨著腫瘤血管體系的形成[1-3]。近年來研究者在許多血液瘤臨床患者的骨髓樣本中也發(fā)現(xiàn)了大量增生的微血管。這說明無論是對實體瘤還是血液瘤，血管生成都發(fā)揮著重要作用?？寡苌芍委熞阎鸩桨l(fā)展成為腫瘤治療的一種有效方法[4]。VEGF是目前所知的最強的直接作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子，VEGF/VEGFR2信號通路是調(diào)節(jié)血管新生的重要通路之一[5]。針對VEGF通路已上市多種藥物，其中單抗隆抗體有抗VEGF的貝伐單抗(bevacizumab，Avastin)以及抗VEGFR2的雷莫蘆單抗(ramucirumab，IMC-1121B)。其中雷莫蘆單克隆抗體通過結(jié)合VEGFR2，阻斷VEGF與其結(jié)合，抑制VEGFR2的磷酸化，從而抑制其下游一系列信號通路，達到抑制腫瘤生長的作用[6-7]。但在治療過程中，抗體藥物單獨用藥不能明顯提高患者的生存期，且伴隨嘔吐、腹瀉、高血壓等不良反應(yīng)及耐藥等問題，限制了其在臨床的使用[8-9]。如何提高雷莫蘆單抗的藥效，降低不良反應(yīng)，成為抗腫瘤血管生成抗體在臨床應(yīng)用中亟需解決的問題。

MIC基因?qū)儆诳缭組HC-Ⅰ類區(qū)域的非經(jīng)典HLA-Ⅰ(human leucocyte antigen-Ⅰ)類基因家族，它包括MICA至MICF 6個成員，MICA和MICB是發(fā)揮功能的重要成員，二者是NK細胞和CD8+T細胞表面活化型受體NKG2D的重要配體[10-11]。其中MICA在大多數(shù)腫瘤細胞如乳腺癌、肺癌及卵巢癌中有表達，被認為是腫瘤相關(guān)性抗原。NK細胞或CD8+T細胞借助NKG2D與腫瘤細胞表面的MICA或MICB相互作用而與腫瘤細胞靠近、結(jié)合并被活化，通過釋放細胞因子等來裂解腫瘤細胞[12-13]。不幸的是，腫瘤細胞會通過脫落MIC分子來抑制免疫細胞的激活，若NKG2D識別了從腫瘤細胞表面脫落的游離MIC分子則不會激活免疫細胞，引起免疫逃逸[14]。因此解決這種免疫抑制現(xiàn)象的關(guān)鍵在于如何重建MICA在腫瘤免疫監(jiān)視作用中的地位。

以腫瘤靶向抗體為基礎(chǔ)設(shè)計雙特異性抗體，在不提高給藥劑量的前提下提高抗體的藥效，是目前抗體工程領(lǐng)域主要研究方向。本課題組前期實驗顯示：通過將MICA分子與本實驗室自主研發(fā)的靶向VEGFR2的單克隆抗體mAb04相融合，借助抗體的靶向性完成對腫瘤細胞的識別，再利用MICA與NKG2D的相互作用，從而激活NKG2D陽性免疫細胞殺傷腫瘤細胞[15]。本實驗室已對mAb04-MICA體外抗白血病細胞K562的活性進行了初步的研究。結(jié)果表明，mAb04-MICA相比于母體單抗mAb04能夠增強免疫細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷，促進白血病細胞K562的凋亡[16]。然而，mAb04-MICA在體內(nèi)的抗白血病能力還尚且未知。本研究旨在鑒定mAb04-MICA對抗原和受體的親和力，并通過建立K562小鼠移植瘤模型，初步探索mAb04-MICA體內(nèi)外抗白血病的藥效。

1 材 料

1.1 試 劑

mAb04-MICA、mAb04抗體由本實驗室構(gòu)建，經(jīng)搖瓶發(fā)酵并純化得到；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Ameresco公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(H+L)(上海生工生物工程有限公司)；CCK8溶液(美國MCE公司)；組化試劑盒DAB顯色液、蘇木精染色液、DAPI(美國Solarbio公司)；VEGFR2抗體、CD34抗體、VEGF抗體、Ki-67抗體(美國SAB公司)；伊馬替尼(瑞士Novartis公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)。

1.2 細胞株

小鼠皮膚黑色素瘤細胞株B16-F10、人慢性粒細胞白血病細胞株 K562、人胚胎腎上皮細胞HEK-293T購自中科院上海細胞所。

1.3 動 物

6周齡雌性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自南京大學南京生物醫(yī)藥研究院，合格證號：201703990。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～26 ℃，所有動物均自由進食水。動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

B16F10細胞貼壁生長，采用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基；K562細胞懸浮生長，采用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。兩株細胞均于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長良好的對數(shù)期細胞進行實驗。

2.2 ELISA鑒定雙特異性抗體的親和力

酶條置于紫外燈下照30 min，每孔加VEGFR2/NKG2D 100 μL，4 ℃包被過夜。每孔加含5%脫脂奶粉的PBS 200 μL，于37 ℃封閉2 h，加入不同質(zhì)量濃度的mAb04-MICA、mAb04、sMICA，對照組加入PBS，37℃孵育2 h。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG (H+L)100 μL，2 h后每孔加入TMB溶液100 μL，室溫避光顯色10 min，每孔加入濃硫酸50 μL終止反應(yīng)。多功能酶標儀測定630和450 nm下的吸收度，并以A450-A630的值，作為最終檢測結(jié)果。

2.3 抗體對K562細胞增殖的作用

培養(yǎng)K562、HEK-293T細胞至匯合度達到約80%，消化細胞并制備成濃度為每毫升5×104個細胞的單細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h。每孔加入配好的藥物10 μL，48 h后加入CCK-8溶液10 μL，放置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，多功能酶標儀檢測A450。求出抑制率后使用GraphPad Prism 5軟件繪制折線圖。

2.4 抗體對鼠VEGFR2(mVEGFR2)的交叉反應(yīng)

培養(yǎng)B16-F10細胞至匯合度達到約80%，消化細胞并將濃度調(diào)節(jié)至每毫升5×106個細胞，分為5組，每管加入單細胞懸液250 μL。前3組均加入2%FBS-PBS，另外2組分別加入mAb04和抗鼠源VEGFR2的市售抗體Anti-mVEGFR2，冰浴孵育1 h。4 ℃冷凍離心機離心5 min，吸棄上清液。后兩組分別加入Anti-mVEGFR2和mAb04孵育1 h。將帶FITC標記的羊抗人IgG抗體按1∶500稀釋，加入各管細胞中混勻，并置于冰浴進行孵育，每10分鐘混勻1次，共孵育1 h。用2% FBS-PBS 500 μL洗滌，PBS 500 μL重懸腫瘤細胞，使用流式細胞儀進行檢測，并用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。以上所用mAb04和Anti-mVEGFR2濃度均為200 nmol/L。

2.5 K562移植瘤裸鼠模型的建立

培養(yǎng)K562細胞，數(shù)目足夠時，離心細胞，用含10% FBS RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為每毫升2×108個細胞。取細胞懸液50 μL與Matrigel基質(zhì)膠50 μL混合，接種6周齡的BALB/c裸鼠。待K562實體瘤形成后，剝瘤，以組織接種法接種于新的6周齡BALB/c裸鼠。如此體內(nèi)穩(wěn)定3代后，植瘤成功率達到95%以上，K562移植瘤裸鼠模型建立成功。

2.6 K562移植瘤裸鼠給藥方法

將成功建模的K562荷瘤裸鼠分為6組，每組分別給藥mAb04(5 mg/kg)、mAb04-MICA(1 mg/kg)、mAb04-MICA(2.5 mg/kg)、mAb04-MICA(5 mg/kg)、伊馬替尼(60 mg/kg)，無菌PBS。每3天給藥1次，給藥體積為100 μL，每次給藥均測量腫瘤體積，按以下公式計算瘤體積(V=LW2/2，其中L代表腫瘤最長徑，W代表與腫瘤最長徑垂直的最大橫徑)。給藥10次以后，以離頸方式處死荷瘤裸鼠并解剖取瘤，對離體的瘤組織稱重并繪制瘤重分布圖，根據(jù)最終瘤重計算抑瘤率。未處死取瘤的移植瘤裸鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)觀測各組移植瘤裸鼠的生存期并繪制曲線。

2.7 免疫組化檢測腫瘤組織增殖及血管生成相關(guān)指標

腫瘤組織保存在4%多聚甲醛溶液中。切片用二甲苯脫蠟2次，0.1%的Triton-X100處理15 min，10%山羊血清的PBS溶液封閉，室溫1 h。在1%山羊血清的PBS溶液中加入特異性一抗1∶100，4 ℃過夜孵育。在無血清的PBS溶液中加入帶HRP標記二抗1∶100，室溫3 h。切片染色，使用DAB試劑盒，將溶液A和溶液B 50 μL與雙蒸水900 μL混合，滴在切片組織上，室溫孵育5 min。蘇木素染色液染核2 min。切片依次用50%、70%、80%、90%和100%乙醇洗1次，每次2 min。風干后，加封片劑，蓋上蓋玻片。倒置熒光顯微鏡拍照(×100)。

3 結(jié) 果

3.1 雙特異性抗體與VEGFR2和NKG2D的結(jié)合能力

采用ELISA鑒定雙特異性抗體與VEGFR2及NKG2D在分子水平上的結(jié)合能力。如圖1所示，mAb04-MICA與抗原具有較為良好的親和活性。其中mAb04-MICA與VEGFR2顯示了較高的親和力，且與母體單抗mAb04幾乎一致，證明了MICA分子的融合并沒有影響抗體對抗原的結(jié)合。同時，MICA與NKG2D的親和活性也得以完整保留。因此與預期的親和活性類似，能與抗原VEGFR2及受體NKG2D進行結(jié)合。

3.2 抗體在體外對K562細胞增殖的影響

在藥物作用48 h后，用CCK8法檢測雙特異性抗體對K562細胞的增殖抑制作用。如圖2所示，雙特異性抗體能夠有效抑制VEGF誘導下的K562細胞的增殖能力，并且抑制作用具有濃度依賴性；半數(shù)抑制率在10-8mol/L水平，與陽性藥伊馬替尼相當。但是對VEGF誘導下的VEGFR2陰性表達的HEK-293T細胞增殖無抑制作用。mAb04-MICA能特異性地阻礙VEGF與K562細胞表面VEGFR2的結(jié)合進而抑制細胞的增殖，在發(fā)揮抗腫瘤活性的同時能夠確保安全性。

A:Binding affinity of the fusion protein to recombinant VEGFR2;B:Binding affinity of the fusion protein to recombinant NKG2D

3.3 流式細胞儀檢測mAb04-MICA對mVEGFR2的結(jié)合能力

如圖3-A和3-B所示，mAb04-MCIA和Anti-mVEGFR2對B16F10都有很高的結(jié)合能力，分別是27.1%、32.6%。用mAb04-MCIA封閉mVEGFR2后Anti-mVEGFR2對其失去結(jié)合能力，結(jié)合率僅為3.57%(圖3-C)。同樣的，先用Anti-mVEGFR2封閉mVEGFR2后，mAb04-MCIA對其結(jié)合率僅為1.79%(圖3-D)，表明靶向人VEGFR2的mAb04-MICA對高表達mVEGFR2的鼠源腫瘤細胞具有識別和結(jié)合能力，與鼠源VEGFR2和人源VEGFR2具有高度同源性結(jié)論一致，為該人源抗體在小鼠體內(nèi)進行進一步的藥學活性和毒性研究提供了理論依據(jù)和實驗支持。此外，高表達VEGFR2的腫瘤細胞經(jīng)過mAb04-MCIA預處理，能夠阻斷市售Anti-mVEGFR2對細胞的結(jié)合作用，更進一步說明了該雙特異性抗體對抗原VEGFR2的特異靶向性和專一性。

Figure3 mAb04-MICA targeting human VEGFR2 can also target to mVEGFR2

A:Commercially available anti-mVEGFR2 antibody showed high binding ability to mVEGFR2;B:mAb04-MICA showed high binding ability to mVEGFR2;C:Anti-mVEGFR2 antibody showed nearly no binding to mVEGFR2 after blocking with mAb04-MICA;D:mAb04-MICA showed nearly no binding to mVEGFR2 after blocking with anti-mVEGFR2 antibody

3.4 mAb04-MICA對K562小鼠移植瘤生長的抑制作用

K562移植瘤模型建模后，待瘤體積達到100 mm3時開始給藥(day 1)，每3日經(jīng)皮下給藥1次，測量并記錄瘤體積，繪制移植瘤生長曲線(圖4-B)。移植瘤裸鼠剝瘤后，按組別對移植瘤瘤塊進行拍照(圖4-A)，不同給藥組之間移植瘤體積存在差異。瘤塊離體后測量瘤重，繪制分布圖，如圖4-C所示。圖4-D展示依據(jù)最終瘤重計算所得各組藥物的抑瘤率：高劑量mAb04-MICA組抑瘤率高達69.6%，母體單抗組為49.9%，伊馬替尼處理組為68.1%。依據(jù)圖4-B和4-C的結(jié)果以及t檢驗結(jié)果顯示：(1)mAb04-MICA的抑瘤率呈濃度依賴性；(2)高劑量mAb04-MICA組的抑瘤率明顯高于同等劑量的母體單抗組；(3)高劑量mAb04-MICA組的抑瘤率等同于市售治療白血病一線藥伊馬替尼組；綜上所述，雙特異性抗體mAb04-MICA比母體單抗mAb04更加有效的抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生長，與伊馬替尼的抑瘤效果無顯著性差異。

3.5 mAb04-MICA對K562荷瘤小鼠生存期的影響

結(jié)合圖5發(fā)現(xiàn)，相同劑量的雙特異性抗體mAb04-MICA比母體單抗mAb04更有效的延長荷人白血病裸鼠的生存期，mAb04-MICA延長荷瘤鼠的生存期的活性呈濃度依賴性，且高劑量組與陽性對照藥伊馬替尼相當。此結(jié)果與荷K562裸鼠瘤體積生長及瘤重分布結(jié)果一致。

3.6 免疫組化檢測瘤組織中Ki-67表達量

從免疫組化結(jié)果(圖6)可以觀察到：和陰性對照相比mAb04-MICA可以明顯抑制荷人白血病裸鼠皮下移植瘤組織中Ki-67的表達，且呈mAb04-MICA濃度依賴性。Ki-67是一種增殖細胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細胞增殖中不可或缺，Ki-67作為標記細胞增殖狀態(tài)的抗原，其表達量的減少說明mAb04-MICA可以有效抑制裸鼠腫瘤細胞的增殖。

3.7 免疫組化檢測腫瘤組織血管生成相關(guān)指標

VEGF/VEGFR2信號通路激活的第一步是VEGFR2的二聚化和磷酸化，在體內(nèi)，隨瘤體積的增大伴隨旁分泌VEGF增加，血管增生，以滿足瘤組織養(yǎng)料的供應(yīng)。從圖7-A，圖7-B可以看出，和陰性對照相比mAb04-MICA可以明顯抑制K562移植瘤裸鼠皮下移植瘤組織中p-VEGFR2、VEGF的表達量，且呈濃度依賴性。p-VEGFR2表達量減少說明mAb04-MICA可以有效抑制裸鼠腫瘤細胞表面VEGFR2的磷酸化。VEGF減少則說明mAb04-MICA可以通過抑制VEGFR2的磷酸化來反向下調(diào)VEGF的表達，從而抑制血管新生。CD34是新生血管標志物，CD34的減少(圖7-C)也從一個方面說明mAb04-MICA大大減少了腫瘤新生血管的數(shù)量和密度。

A:Images of tumors peeled from different treatments in BALB/c nude mouse model;B:Tumor growth curves of each group under different treatments;C:Average tumor weights of different groups after 30-day treatment;D:Inhibitory rate of different groups

*P<0.05,**P<0.01,ns:no significance

Figure5 Survival of tumor-bearing mice after 100-day tumor challenge

Figure6 Proliferate of tumor cells under different treatments was detected by IHC staining of Ki-67 (brown staining)

Figure7 IHC staining tumor tissue in K562 xenograft (×100)

A:IHC staining of p-VEGFR2 on paraffin sections of xenografted tumor.p-VEGFR2+cells were identifed with an anti-Ki-67 antibody (brown staining);B:IHC staining of VEGF (brown staining);C:IHC staining of CD34.The CD34+blood vessels were identifed with an anti-CD34 antibody (brown staining).Photomicrographs showed representative pictures from 3 independent tumor samples

4 討 論

白血病是一種異質(zhì)性群體疾病，在我國兒童和35歲以下人群中致死率排名第一[17]。研究表明，白血病能夠表達具有功能的VEGFR2從而促進腫瘤的增殖[18]。

前期工作中，本課題組獲得了可以特異性靶向VEGFR2的全人源抗體mAb04，具有較高的對VEGFR2的親和力、抗血管生成作用和抗腫瘤活性[19]。在其基礎(chǔ)上，本課題組設(shè)計出雙特異性抗體mAb04-MICA，在保留母體單抗mAb04抗血管功能的同時，重塑NKG2D途徑介導的免疫監(jiān)視，將靶向性抗體與具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白偶聯(lián)，在盡可能減少給藥劑量的情況下，最大限度發(fā)揮抗腫瘤作用。

本實驗室已對雙特異性抗體mAb04-MICA體內(nèi)外抗血管生成和抗乳腺癌的活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其能夠有效抑制腫瘤組織中新生血管的形成，并且通過MICA分子將NK細胞募集至腫瘤微環(huán)境中，重建免疫免疫監(jiān)視作用[15,20-21]。此外，mAb04-MICA體外抗K562細胞的活性研究表明其可以促進K562細胞的凋亡和阻滯細胞周期[16]。

本文研究了雙特異性抗體mAb04-MICA對白血病細胞K562的體內(nèi)外抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，mAb04-MICA對抗原VEGFR2和MICA的受體NKG2D均具有良好的結(jié)合，能夠顯著抑制K562的體外增殖，而對VEGFR2低表達的HEK-293T不顯示增殖抑制作用，進一步說明了該雙特異性抗體的特異性抗腫瘤活性。

考慮到mAb04-MICA為人源抗體，盡管人源和鼠源的VEGFR2同源性高達86.37%，抗人VEGFR2的抗體對鼠源VEGFR2(mVEGFR2)的靶向性仍有待驗證。B16-F10是VEGFR2高表達的的小鼠黑色素瘤細胞株，選作mVEGFR2載體。首先通過B16-F10的流式結(jié)合實驗驗證了mAb04-MICA對于mVEGFR2的高親和性。選用T淋巴細胞免疫缺陷型裸鼠進行K562細胞的植瘤。以臨床治療白血病的一線藥物伊馬替尼為陽性對照藥，初步驗證了雙特異性抗體mAb04-MICA的抗腫瘤活性較mAb04單抗顯著增強。通過免疫組化方法測定瘤組織中Ki-67、p-VEGFR2、VEGF及CD34的表達，結(jié)果顯示mAb04-MICA可以通過抑制腫瘤細胞VEGFR2的磷酸化，降低p-VEGFR2的表達，減少VEGF在腫瘤組織部位的表達和富集，有效抑制VEGF/VEGFR2通路的活化，進而抑制腫瘤新生血管的生成，達到抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長的抗腫瘤活性。觀測各組移植瘤裸鼠的生存期，發(fā)現(xiàn)mAb04-MICA可以劑量依賴性地抑制K562移植瘤的生長，在生存期延長上比mAb04單抗顯著增強，與伊馬替尼藥效相當，但是相比化學療法，該雙特異性抗體在恢復患者免疫系統(tǒng)功能上具有更大的優(yōu)勢，這一點對于預后非常重要。

mAb04-MICA通過抑制腫瘤新生血管和重塑免疫監(jiān)視機制，突破了抗體在白血病領(lǐng)域的治療效果。本文探究了其抗血管作用，對于免疫系統(tǒng)的恢復方面，后續(xù)還需要進行相關(guān)指標的檢測，如通過檢測CD11b分子的表達觀測NK細胞在腫瘤組織中的浸潤情況，通過檢測腫瘤組織中IFN-γ和TNF-α的分泌來檢測雙特異性抗體對NK細胞的激活作用等。

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