宋鳳娟，艾永玲，鐘文英,2*，王 菁,2**

(中國(guó)藥科大學(xué) 1醫(yī)藥生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

Cu2+是人體內(nèi)及許多生物體內(nèi)重要的金屬元素之一，它對(duì)于人體的新陳代謝、免疫系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用[1]。此外，Cu2+還可以與多種藥物分子形成配合物以改變藥物的療效。傳統(tǒng)檢測(cè)Cu2+的方法有分光光度法[2]、原子吸收光譜法[3]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[4]等，而這些方法都存在前處理比較復(fù)雜、儀器價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。因此，建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)微量Cu2+方法是非常有必要的。

谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸3種氨基酸組成[5],GSH對(duì)于細(xì)胞的多種功能有重要作用[6-7]，同時(shí)GSH的巰基能與多種化學(xué)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物相結(jié)合，使其作為藥物被廣泛應(yīng)用[8-9,14-15]。因此，建立準(zhǔn)確快速測(cè)定GSH的方法能為臨床提供很多有用信息。通常用于檢測(cè)GSH的方法有高效液相色譜法[10]、高效毛細(xì)管電泳法[11]、電化學(xué)法[12]等。這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，但存在操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等不足。近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光分析方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分析方法的不足，尤其是基于量子點(diǎn)(QDs)熒光分析方法，已發(fā)展成為一種新型并有效的方法。

相比于傳統(tǒng)的熒光有機(jī)染料，QDs具有寬激發(fā)、窄發(fā)射、高熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的分析探針[13]。其中石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)是最近發(fā)現(xiàn)的粒徑小于100 nm具有零維結(jié)構(gòu)的石墨烯納米片[14]。與傳統(tǒng)的QDs相比，GQDs具有較好的光穩(wěn)定性、高的熒光活性、良好的抗光漂白能力和生物相容性，在各個(gè)領(lǐng)域引起較大關(guān)注并成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。與此同時(shí)，越來(lái)越多的研究開始著重于發(fā)展一種能夠順序檢測(cè)不同陽(yáng)離子和氨基酸的傳感技術(shù)[15-16]。

基于以上出發(fā)點(diǎn)，本研究在溫和的條件下氧化石墨粉，得到高分散、高熒光強(qiáng)度的GQDs溶液，并實(shí)現(xiàn)了順序檢測(cè)Cu2+和GSH。由于GQDs表面的羧基能與Cu2+通過(guò)靜電相互作用，使熒光強(qiáng)度降低；而當(dāng)體系中存在有GSH時(shí)，GSH的巰基又可與Cu2+相結(jié)合，形成Cu-SR鍵，使GQDs的熒光恢復(fù)。因此，本研究利用GQDs熒光猝滅-恢復(fù)的現(xiàn)象建立了一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確檢測(cè)Cu2+與GSH的方法，并應(yīng)用于含Cu2+與GSH實(shí)際樣品的測(cè)定。

1 材 料

1.1 試 劑

谷胱甘肽(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石墨粉(南京先豐納米材料科技有限公司)；其他試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(電阻系數(shù)≥18.2 MΩ·cm，Milli-Q，Millipore)。

1.2 儀 器

UV-3600紫外可見吸收光譜儀，IRAffinity-1S紅外光譜儀(日本島津公司)；Fluoromax-4熒光光譜儀(日本Horiba公司)；2000型透射電子顯微鏡(TEM，日本Jeol公司)；BS110S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；pHS-25型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

2 方 法

2.1 GQDs的制備

GQDs按文獻(xiàn)[17]方法合成有所改進(jìn)，具體步驟為：稱取石墨粉1.0 g，置于聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，加入濃H2SO4180 mL與濃HNO360 mL，混合均勻，超聲2 h，80 ℃水浴加熱24 h。冷卻至室溫后，用超純水800 mL稀釋，對(duì)所獲得的GQDs溶液用Na2CO3溶液中和至中性，透析、冷凍干燥，配制成1 mg/mL的GQDs儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱待用。

2.2 熒光法檢測(cè)Cu2+

稱取CuSO4·5H2O適量，用超純水溶解，配制成不同濃度系列的Cu2+溶液。在1.5 mL離心管中，依次加入1 mg/mL的GQDs溶液50 μL和不同濃度的Cu2+儲(chǔ)備液50 μL，再用超純水定容至500 μL，渦旋混勻，于室溫下放置20 min。以370 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，選狹縫寬度為10 nm/10 nm，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

2.3 熒光法檢測(cè)GSH

稱取GSH適量，用超純水溶解，配制成不同濃度系列的GSH溶液。取經(jīng)過(guò)100 mmol/L Cu2+猝滅的GQDs溶液450 μL，加入不同濃度的GSH儲(chǔ)備液50 μL，渦旋混勻。以370 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，選狹縫寬度為10 nm/10 nm，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 GQDs的表征

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)石墨粉進(jìn)行混酸氧化的方式制備了GQDs，利用透射電子顯微鏡、熒光光譜儀、紫外可見吸收光譜儀對(duì)合成的GQDs進(jìn)行表征，如圖1所示。圖1-A為GQDs的TEM圖譜與粒徑分布圖譜，可見合成的GQDs的粒徑約為5 nm，且分散均勻，這與粒徑分布圖集中顯示的4～6 nm一致，結(jié)果表明用此方法合成的GQDs在溶液中大小均一、高度分散。如圖1-B，1-C所示，激發(fā)波長(zhǎng)在300～370 nm之間，GQDs的熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長(zhǎng)的紅移而增加，在激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm時(shí)達(dá)到峰值，隨后熒光強(qiáng)度逐漸降低，且發(fā)射峰位置在激發(fā)波長(zhǎng)300～400 nm之間并沒有明顯的變化。因此本研究選取370 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，GQDs的熒光最大發(fā)射峰的位置為458 nm。紫外可見光譜圖1-D中230 nm與270 nm的吸收峰為GQDs的特征峰，230 nm的吸收峰是C==C的π-π*躍遷形成，而270 nm的吸收峰是C==O的n-π*躍遷形成。從GQDs的紅外光譜圖1-E可見，在3 447 cm-1處存在C-OH的伸縮振動(dòng)峰，C==C的伸縮振動(dòng)峰為1 640 cm-1，C-O-C的振動(dòng)峰為1 093 cm-1，紅外光譜圖表明用此方法合成的GQDs表面含有豐富的含氧官能團(tuán)。此外合成的GQDs熒光強(qiáng)度對(duì)pH有較強(qiáng)的依賴性，如圖1-F所示，在pH為7時(shí)GQDs的熒光強(qiáng)度最高，因此選擇此為體系反應(yīng)pH。

Figure1 Characterization of graphene quantum dots (GQDs)

A:TEM images of GQDs,Inset:Corresponding size distribution of GQDs;B:Fluorescence spectra of GQDs at different excitation wavelengths:(a) 300 nm;(b) 325 nm;(c) 350 nm;(d) 360 nm;(e) 370 nm;(f) 380 nm;(g) 400 nm;C:Excitation spectra (a) and emission spectra (b) of GQDs;D:UV-Vis spectra of GQDs;E:FT-IR spectra of GQDs;F:Relationship between pH value and fluorescence intensity

3.2 Cu2+與GSH對(duì)GQDs熒光光譜的影響

實(shí)驗(yàn)研究表明，Cu2+和GSH先后加入GQDs溶液，會(huì)顯著改變GQDs的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2所示。由圖2曲線a、b比較可見，GQDs在加入100 mmol/L Cu2+溶液50 μL之后，熒光強(qiáng)度大幅度降低，這是由于GQDs表面的羧基基團(tuán)與Cu2+通過(guò)靜電作用結(jié)合，GQDs處于激發(fā)態(tài)的電子轉(zhuǎn)移至Cu2+未占有電子能級(jí)的最低軌道上，GQDs的電子以非輻射的形式回到基態(tài)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[18]。而隨著GSH的加入到這個(gè)猝滅體系中，GQDs的熒光強(qiáng)度又逐漸恢復(fù)(曲線c)。但若體系中沒有Cu2+存在，而只是加入相同量的GSH，體系的熒光強(qiáng)度與GQDs本身熒光發(fā)射并沒有明顯變化(曲線d)。這是由于GSH的巰基基團(tuán)只與Cu2+結(jié)合，從而形成Cu-SR鍵，Cu-SR鍵的強(qiáng)度大于靜電作用力的強(qiáng)度，因此Cu2+會(huì)逐漸從GQDs表面脫離下來(lái)，使得GQDs的熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)。

3.3 熒光猝滅法對(duì)Cu2+的濃度測(cè)定

GQDs熒光猝滅的程度與Cu2+的濃度直接相關(guān)。圖3-A呈現(xiàn)了隨著不同濃度Cu2+的加入，GQDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)Cu2+的濃度達(dá)到100 mmol/L后，GQDs的熒光強(qiáng)度隨著Cu2+加入變化很小，基本上已經(jīng)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，因此后續(xù)檢測(cè)GSH時(shí)，取Cu2+的濃度為100 mmol/L。Cu2+的濃度測(cè)定結(jié)果如圖3-B所示，在1.0～10.0 mmol/L范圍內(nèi)與GQDs的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F=-34 863.81c+762 248.98，線性相關(guān)系數(shù)(r)達(dá)0.995 8，檢測(cè)限是0.01 mmol/L。在相同條件下對(duì)10 mmol/L的Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次平均測(cè)定，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%。以上可證明此熒光猝滅法能準(zhǔn)確檢測(cè)Cu2+。

Figure2 Fluorescence spectra of (a) GQDs，(b) GQDs+Cu2+(100 mmol/L)，(c) GQDs+Cu2+(100 mmol/L)+GSH (1.0 mmol/L) and (d) GQDs+GSH (1.0 mmol/L)

Figure3 Determination of Cu2+concentration by fluorescence quenching

3.4 熒光恢復(fù)法對(duì)GSH的含量測(cè)定

為了考察猝滅后的GQDs熒光恢復(fù)程度能檢測(cè)GSH的具體范圍，本研究向經(jīng)過(guò)100 mmol/L Cu2+猝滅的GQDs溶液中加入不同濃度的GSH溶液，結(jié)果如圖4所示。由于GSH的巰基基團(tuán)與Cu2+的相互作用，隨著不同濃度的GSH的加入，GQDs的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)。但當(dāng)GSH的濃度超過(guò)1.0 mmol/L時(shí)，GQDs的熒光光譜變形，這可能由于GSH與Cu2+反應(yīng)改變了GQDs所處的外界環(huán)境，進(jìn)而影響到峰形。GSH的濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)與GQDs的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，線性方程為F=370 422.25c+243 862.20，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.991 2，檢測(cè)限為0.1 mmol/L。同樣，在相同條件下對(duì)0.6 mmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了6次平均測(cè)定，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%。因此表明這種利用GQDs熒光猝滅-恢復(fù)法對(duì)GSH的檢測(cè)具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

3.5 熒光體系的選擇性考察

特異性是衡量分析方法的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，考察多種金屬離子：Ag+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Al3+、Fe3+單獨(dú)存在以及與Cu2+共存情況下對(duì)GQDs熒光強(qiáng)度的影響。其中其他金屬離子濃度為Cu2+濃度的10倍，測(cè)定熒光強(qiáng)度變化ΔI(ΔI=F0-F,F0為GQDs的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入金屬離子后的熒光強(qiáng)度)。結(jié)果如圖5-A所示，除了Cu2+能顯著猝滅GQDs的熒光發(fā)射，其余的離子對(duì)GQDs的熒光強(qiáng)度影響不大，可以說(shuō)明該方法對(duì)Cu2+的檢測(cè)有很好的選擇性。

同樣，本研究也考察了GSH檢測(cè)中共存物質(zhì)的潛在干擾，在經(jīng)過(guò)Cu2+猝滅的GQDs溶液中分別加入4種不同的蛋白：半胱氨酸、葡萄糖、賴氨酸、多巴胺，其濃度均設(shè)為GSH濃度的10倍，測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化ΔI′(ΔI′=F′-F0′,F′為加入蛋白后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0′為被100 mmol/L Cu2+猝滅后的GQDs熒光強(qiáng)度)，如圖5-B所示，加入GSH之后GQDs的熒光強(qiáng)度有明顯增強(qiáng)，然而其他蛋白并不能明顯改變GQDs的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示此檢測(cè)方法能很好地檢測(cè)GSH，并不受其余干擾物質(zhì)的影響。

Figure4 Determination of GSH concentration by fluorescence recovery

Figure5 Selectivity of the fluorescence system

3.6 實(shí)際樣品分析

為了進(jìn)一步探索本檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣品的應(yīng)用，本研究利用藥品阿司匹林能與加入的硫酸銅絡(luò)合形成阿司匹林銅，在測(cè)定之前用鹽酸與阿司匹林銅反應(yīng)使得絡(luò)合的Cu2+再次游離到溶液中，用該方法檢測(cè)所加入的Cu2+濃度。加入的濃度分別為3.0、5.0、7.0 mmol/L，結(jié)果如表1所示回收率在93.33%～101.4%，RSD不大于4%，同樣，采用加標(biāo)回收法測(cè)定人血清樣品中GSH的含量，加入濃度分別為0.30、0.50、0.70 mmol/L，結(jié)果表明回收率在95.76%～106.7%，RSD均小于5%，因此，此檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果也令人滿意。

Table1 Determination of Cu2+and GSH in practical samples

SampleAdded/(mmol/L)Found/(mmol/L)Recovery/%RSD/(%，n=5)Copper?aspirincomplex302893334050531060327071101435Serumsample030032106748050049980225070067957638

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)在溫和條件下氧化石墨粉成功合成單分散的GQDs溶液，熒光強(qiáng)度高，粒徑均一，并且利用GQDs熒光猝滅-恢復(fù)的效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cu2+與GSH靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限分別為0.01和0.1 mmol/L。本文所建立的分析方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、精密度高、操作簡(jiǎn)便，未來(lái)有希望為藥物開發(fā)、藥物檢測(cè)提供支持。

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