宮雪，于柳，祝興旺，劉嘉，劉屹立，王平

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110032）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，常規(guī)行手術(shù)切除，但晚期患者手術(shù)療效較差，放化療等輔助治療不敏感，患者生命受到嚴(yán)重威脅。因此，針對膀胱癌的靶向治療研究具有極其重要的臨床意義。Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一個成員［1］，參與再循環(huán)內(nèi)體的形成，在有絲分裂紡錘體形成和定位的過程中發(fā)揮不可或缺的作用［2］。據(jù)文獻(xiàn)［3-6］報道，Rab11與皮膚癌、乳腺癌、食管腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病進展有關(guān)。本課題組的前期實驗通過免疫組織化學(xué)方法證實了Rab11在膀胱癌組織中過表達(dá)，并與膀胱癌細(xì)胞的侵襲深度顯著相關(guān)。本研究在膀胱癌T24細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA，抑制Rab11蛋白的表達(dá)，以探討抑制Rab11表達(dá)對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和侵襲的作用和機制，為晚期膀胱癌的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人膀胱癌細(xì)胞系T24 （美國ATCC公司） ；Rab11（美 國Proteintech公 司） ，cyclin D1、cyclin E、基 質(zhì) 金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP9） （美國Cell Signaling公司） ，β-actin （美國Santa Cruz公司） ；Rab11 ONTARGETplus siRNA，陰性對照NonTarget-ing siRNAa （美國Dharmacon公司） ；ECL試劑盒（美國Pierce公司） ；qRT-PCR試劑盒SYBR Green Master Mix Kit（美國Applied Biosystem公司）。發(fā)光儀器為DNR BioImaging System （以色列DNR公司），PCR儀為7500 Real-Time PCR System。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

膀胱癌T24細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液。取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞懸液接種于6孔板中 （約1×106/孔） 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，確保細(xì)胞密度＞80%后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟及劑量參照說明書。將轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA的T24細(xì)胞作為實驗組（Rab11 siRNA組） ，轉(zhuǎn)染Control siRNA的T24細(xì)胞作為對照組 （Control siRNA組） 。

1.3 免疫印跡法

轉(zhuǎn)染48 h后，收集T24細(xì)胞，裂解提取總蛋白，用BCA法行目標(biāo)蛋白定量，上樣量為20 μ g，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗Rab11（ 1∶800） 、cyclin D1、cyclin E、MMP9（ 1∶1 000） ，β-actin（ 1∶2 000） ，4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光。通過凝膠分析系統(tǒng)掃描目的條帶和內(nèi)參的灰度對比，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.4 CCK8法

取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，接種后轉(zhuǎn)染，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。于檢測細(xì)胞增殖率4 h前加入10 μ L CCK8溶液處理細(xì)胞，通過酶標(biāo)儀分析細(xì)胞增殖率變化，選用波長為490 nm。采用CCK8試劑盒，按照產(chǎn)品說明操作。

1.5 細(xì)胞周期檢測

將T24細(xì)胞接種后轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用1%的多聚甲醛進行固定，用PBS緩沖液漂洗，用無RNA酶的碘化丙啶 （5 mg/mL） 對細(xì)胞進行染色。采用流式細(xì)胞儀，分析細(xì)胞內(nèi)核DNA分布的規(guī)律，繪制直方圖。

1.6 基質(zhì)膠侵襲實驗

將Matrigel用培養(yǎng)液稀釋，每孔20 μ L Matrigel進行鋪膜 （24孔板） 。轉(zhuǎn)染48 h后，收集T24細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋制備細(xì)胞懸液 （1×105/mL） 。上室中每孔加入200 μ L細(xì)胞懸液，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液800 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS緩沖液沖洗，進行蘇木精染色，室溫干燥過夜。顯微鏡下對細(xì)胞進行計數(shù)，重復(fù)實驗3次。

1.7 實時PCR

按試劑盒步驟提取總RNA，測定濃度及純度，使用7500 Real-Time PCR System將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增過程中所用內(nèi)參為β-actin。基因表達(dá)的相對量用ΔCt值代表，其中ΔCt =Ct基因-Ct內(nèi)參，基因擴增倍數(shù)的估測方法采用2-ΔΔCt估測法。重復(fù)實驗3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫印跡法檢測T24細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA的轉(zhuǎn)染效率

采用免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，Rab11 siRNA組與Control siRNA組相比，T24細(xì)胞系中Rab11表達(dá)量顯著下調(diào) （圖1） 。

圖1 免疫印跡法檢測Rab11 siRNA的干擾效率Fig.1 RNA interference efficiency of the Rab11 siRNA determined by performing Western blotting

2.2 抑制Rab11表達(dá)能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖

采用CCK8法分析抑制Rab11表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，Rab11 siRNA組與Control siRNA組相比，第3天時膀胱癌細(xì)胞的增殖率明顯降低（P ＜ 0.05） ，見圖2。

2.3 抑制Rab11表達(dá)能抑制膀胱癌細(xì)胞周期進程

通過流式細(xì)胞術(shù)分析抑制Rab11表達(dá)對細(xì)胞周期進程的影響，結(jié)果表明，Rab11 siRNA組與Control siRNA組相比，G1期細(xì)胞數(shù)目明顯上升，S期細(xì)胞數(shù)目明顯下降 （圖3） 。

2.4 抑制Rab11表達(dá)能抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力

圖2 CCK8實驗檢測抑制Rab11表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Rab11 inhibition on the proliferation of bladder cancer cells determined by performing the CCK8 assay

通過基質(zhì)膠侵襲實驗分析抑制Rab11表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果表明，Rab11 siRNA組與Control siRNA組相比，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目明顯減少 （分別為96±7和189±11，P ＜0.05），見圖4。

2.5 抑制Rab11表達(dá)顯著下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin E和侵襲相關(guān)蛋白MMP9的表達(dá)量

通過免疫印跡法和實時PCR技術(shù)分析抑制Rab11表 達(dá) 對T24細(xì) 胞 系 中cyclin D1、cyclin E和MMP9表達(dá)情況的影響，結(jié)果表明，Rab11 siRNA組與Control siRNA組相比，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin E和侵襲相關(guān)蛋白MMP9的蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著降低（P ＜ 0.05） ，見圖5。

3 討論

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析抑制Rab11表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞周期進程的影響Fig.3 Effect of Rab11 inhibition on cell cycle progression in bladder cancer cells determined by performing flow cytometry

圖4 基質(zhì)膠侵襲實驗分析抑制Rab11表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響 ×200Fig.4 Effect of Rab11 inhibition on the invasive ability of bladder cancer cells determined by performing the Matrigel invasion assay ×200

圖5 免疫印跡法和實時PCR檢測轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA的T24細(xì)胞系中cyclin D1、cyclin E和MMP9的表達(dá)情況Fig.5 Expression of cyclin D1，cyclin E，and MMP9 in T24 cells transfected with the Rab11 siRNA determined by performing Western blotting and RT-PCR

Rab11能夠調(diào)控Rac活性的相對水平，并且在多細(xì)胞運動型結(jié)構(gòu)形成過程中有利于單個細(xì)胞的形成。Rab11能調(diào)節(jié)再循環(huán)內(nèi)體的形成、運輸，并引導(dǎo)攜帶受體的膜泡錨定于質(zhì)膜之上，從而實現(xiàn)了受體和脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)利用。近年文獻(xiàn)［4-5］報道，Rab11與皮膚癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生進展相關(guān)。Rab11能夠上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，進而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［6］。以上研究表明，Rab11與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期實驗已證實，Rab11在膀胱癌組織中過表達(dá)，并與腫瘤侵襲深度顯著相關(guān)，表明Rab11在膀胱癌的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。本研究在膀胱癌T24細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Rab11 siRNA，分析抑制Rab11表達(dá)對癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進程和侵襲能力的影響，并探討抑制Rab11表達(dá)對細(xì)胞周期相關(guān)因子cyclin D1、cyclin E和侵襲相關(guān)因子MMP9的作用。

本研究采用Rab11 siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，下調(diào)T24細(xì)胞系中 Rab11的表達(dá)量。結(jié)果表明，抑制Rab11表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。通過流式細(xì)胞術(shù)分析抑制Rab11表達(dá)對細(xì)胞周期進程的影響，結(jié)果表明細(xì)胞周期進程受到阻遏，G1期到S期的轉(zhuǎn)化受到抑制。為進一步研究抑制Rab11表達(dá)對細(xì)胞周期進程的作用機制，檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Rab11表達(dá)能夠下調(diào)cyclin D1和cyclin E的表達(dá)量。cyclin D1和cyclin E蛋白在G1～S期的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用［7-8］。本研究結(jié)果表明，在T24細(xì)胞系中Rab11通過調(diào)控cyclin家族蛋白的表達(dá)，進而調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進程。

基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了Rab11 siRNA的T24細(xì)胞系其侵襲能力明顯降低。MMP9在細(xì)胞中的主要作用是減少基底膜中膠原蛋白的含量，在膀胱癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中至關(guān)重要［9-12］。深入研究受Rab11調(diào)控的與侵襲能力相關(guān)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)MMP9可能是Rab11蛋白作用的一個潛在靶基因。本研究結(jié)果顯示，抑制Rab11表達(dá)后MMP9的表達(dá)量也明顯降低。因此，Rab11可能是通過調(diào)控侵襲相關(guān)因子MMP9的表達(dá)量進而調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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