劉有菊 馬文俊 袁發(fā)榮 曾志斌

【摘要】目的：對金訶牌清瑞膠囊的食用安全性進(jìn)行毒理學(xué)評價。方法：依據(jù)食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法進(jìn)行急性毒性試驗、遺傳毒性試驗（Ames試驗、骨髓細(xì)胞微核試驗和精子畸形試驗）、大鼠30d喂養(yǎng)試驗。結(jié)果：小鼠急性毒性試驗經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均>20g/kg.bw，屬無毒級。Ames試驗、骨髓細(xì)胞微核試驗和精子畸形試驗結(jié)果均為陰性，表明受試物無致突變作用，30d喂養(yǎng)試驗，試驗動物均生長發(fā)育良好，體重、攝食量、血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)及病理組織學(xué)相關(guān)指標(biāo)均未見異常變化。結(jié)論：金訶牌清瑞膠囊急性毒理分級屬無毒級，無遺傳毒性，在本試驗劑量范圍內(nèi)，金訶牌清瑞膠囊屬于安全性保健食品。

【關(guān)鍵詞】金訶牌清瑞膠囊;毒理學(xué);安全性

金訶牌清瑞膠囊以蝙蝠蛾擬青霉菌粉、三七、枸杞子提取物、紅景天提取物、絞股藍(lán)提取物為主要原料組方。其中蝙蝠蛾青霉菌粉為冬蟲夏草的菌株經(jīng)人工發(fā)酵獲得的冬蟲夏草真菌，其藥理學(xué)與蟲草相似，有補(bǔ)肺腎、止咳、益虛損的作用;三七可補(bǔ)血、活血化瘀枸杞子提取物可補(bǔ)肝益腎、益精明;紅景天提取物可益氣活血、通脈平喘;絞股藍(lán)提取物消炎解毒、止咳祛痰。本配方主要從調(diào)理氣血、腎肺三方面來調(diào)節(jié)人體的免疫功能。全方益氣補(bǔ)血、補(bǔ)腎益肺、活血化瘀、解毒、化痰，注意整體調(diào)節(jié)，扶正驅(qū)邪，達(dá)到增強(qiáng)免疫力的保健功效。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

金訶牌清瑞膠囊由金訶藏藥股份有限公司提供，人體推薦量為每人4.5g/人·日（成人體重按60kg計），取其內(nèi)容物作為受試物供實驗用。菌種鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA 97a、TA 98、TA 100、TA 102四種菌株，由廣西疾病預(yù)防微生物實驗室提供。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級KM種小鼠，體重18-22g，雌雄各半，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2009-0001;SPF級ICR小鼠，體重25-30g，雌雄各半;SPF級SD大鼠，體重60-90g，雌雄各半;均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0004;飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2008-0005。實驗動物標(biāo)準(zhǔn)飼料為北京華阜康生物科技股份有限公司實驗動物標(biāo)準(zhǔn)飼料，許可證號：SCXK（京）2009-0008號。

1.3 儀器

CELLY HY318血細(xì)胞分析儀（法國Cell公司）;HITACHI7180全自動生化分析儀（日立）。

1.4 方法I1-5]

1.4.1 急性毒性試驗

按最大耐受量試驗方法進(jìn)行，選擇雌雄各10只小鼠，體重18-21g，試驗前空腹16h備用（不限制飲水），稱取10g受試物，以蒸餾水配至30ml，終濃度為0.33g/ml，分三次灌胃給予實驗動物，間隔4h，每次灌胃量為0.2ml/10g-bw，累計染毒劑量為20g/kg-bw，記錄動物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)觀察14d。

1.4.2 污染物致突變性檢測（Ames）試驗

試驗按照平板摻入法，經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株進(jìn)行試驗;采用多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外活化系統(tǒng)（+S9）。受試樣品設(shè)5個劑量組：8、40、200、1000、5000ug/皿，同時設(shè)立自發(fā)回變組、溶劑對照組和陽性對照組。在相同條件下重復(fù)做2次。如果受試物的回變菌落數(shù)增加超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并具有劑量反應(yīng)關(guān)系者，即為誘變試驗陽性。

1.4.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗

昆明種小鼠50只，體重25-30g，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。設(shè)3個試驗組染毒劑量分別為（2.5 g/kg-bw、5g/kg-bw、10 g/kg-bw），同時設(shè)陰性對照組（蒸餾水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg-bw），分別稱取2.5、5.0 g受試物，以蒸餾水配至20ml，終濃度分別為0.125、0.25 g/ml，灌胃給予低、中劑量組實驗動物，灌胃容積為0.2ml/lOg-bw;另取10g受試物，以蒸餾水配至30 ml，終濃度為0.33g/ml，灌胃給予高劑量組實驗動物，灌胃容積為0.3 ml/lOg-bw，給藥后各組均間隔24h兩次灌胃，于第2次灌胃6h后采用頸椎脫臼處死小鼠，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只小鼠計數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE ），微核率以含微核的PCE千分率計，同時計數(shù)200個嗜多染紅細(xì)胞，計算PCE與成熟紅細(xì)胞（NCE）的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布均數(shù)比較法統(tǒng)計處理。

1.4.4 小鼠精子畸形試驗

昆明種雄性小鼠25只，體重28-3 2g，按體重隨機(jī)分為5組。每組5只。設(shè)3個實驗組染毒劑量分別為（ 2.5、5、10 g/kg-bw），同時設(shè)陰性對照組（蒸餾水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg·bw）。分別稱取2.5、5g受試物，以蒸餾水配至20ml，終濃度分別為0.125、0.25 g/ml，灌胃給予低、中劑量組實驗動物，灌胃量為0.2ml/10g·bw;另取lOg受試物，以蒸餾水配至30ml，終濃度為0.33 g/ml，灌胃給予高劑量組實驗動物，灌胃量為0.3ml/10g·bw，每天1次，連續(xù)灌胃5d，從首次灌胃后第35 d采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)附睪涂片，伊紅染色。在高倍鏡下觀察精子形態(tài)，每只小鼠檢查1000個結(jié)構(gòu)完整的精子，記錄畸變類型和數(shù)量，計算精子畸形率（以百分率表示）。

1.4.5 30d喂養(yǎng)試驗

選用67-88 g健康斷乳大鼠80只，隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。根據(jù)人體推薦量設(shè)低、中、高3個試驗組和對照組，染毒劑量分別為1.88、3.75、7.5g/kg-bw（分別相當(dāng)于人體推薦量的25、50、100倍）。各試驗組每天按劑量灌胃給藥，對照組灌以蒸餾水，連續(xù)30 d。按照動物體重的10%計算食物攝入量將受試物摻入飼料中，即1.88%、3.75%、7.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）喂飼實驗動物。高劑量組在基礎(chǔ)飼料中摻入酪蛋白，調(diào)整其蛋白含量為20%（與對照組的基礎(chǔ)飼料中蛋白含量一致）。對照組給予基礎(chǔ)飼料。單籠喂養(yǎng)，自由飲食，連續(xù)觀察30d。試驗中觀察動物一般狀況、進(jìn)食、飲水及活動等;每周稱量1次體重和2次食物攝入量，觀察體重變化，計算每周的食物利用率和總的食物利用率;實驗?zāi)┢诮?6h，稱取動物體重（供計算肝、脾、腎、睪丸等臟器系數(shù)使用）后，斷頭取血，進(jìn)行血液學(xué)和生化血液學(xué)指標(biāo)測定，解剖動物并取材進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Microsoft Excel和spss軟件進(jìn)行均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差的計算和方差分析或秩和檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗

給予受試物后，雌、雄小鼠均未見明顯中毒癥狀，在觀察期間內(nèi)雌、雄小鼠均未見異常反應(yīng)，生長情況良好，無死亡發(fā)生。受試物小鼠經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均>20.0 g/kg-bw。根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，該樣品屬實際無毒級。結(jié)果見表1。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames試驗

由表2、表3可見，兩次試驗中受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量一反應(yīng)關(guān)系，說明在加與不加S-9時該樣品對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗菌株均未呈現(xiàn)遺傳毒性。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗

由表4可見，受試物各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異（P>0.05），而環(huán)磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較有極顯著性差異（P<0.01），說明該樣品無致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗

由表5，表6可見，受試物各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較無顯著性差異（P>0.05），而環(huán)磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較有極顯著性差異（P<0.01），說明該樣品無致小鼠精子畸形作用。

2.3 大鼠30d喂養(yǎng)試驗

2.3.1 動物的一般表現(xiàn)

試驗周期內(nèi)各試驗組動物總體生長狀況良好，體重逐周增長，未見中毒體征及死亡。

2.3.2 體重、食物利用率測定結(jié)果

由表7、表8可見，各試驗組動物每周體重、進(jìn)食量、食物利用率和體重增重、總進(jìn)食量、總食物利用率與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。

2.3.3 血液學(xué)測定結(jié)果

由表9可見，實驗動物各劑量組血液學(xué)指標(biāo)與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05），且其值均在本實驗室正常范圍內(nèi)。

2.3.4 血液生化學(xué)測定結(jié)果

由表10和表11可見，各實驗組動物血液生化各指標(biāo)與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05），且其值均在本實驗室正常值范圍內(nèi)。

2.3.5 病理檢查

2.3.5.1 大體解剖

試驗結(jié)束時對所有動物進(jìn)行大體檢查，肝臟大小正常、顏色新鮮、表面光滑、質(zhì)地柔軟、邊緣銳利、無結(jié)節(jié)包塊等。取出兩側(cè)腎和腎上腺，對準(zhǔn)腎門將腎以最大剖面剖開，暴露腎盂，檢查皮質(zhì)和髓質(zhì)的厚度、顏色正常，界限清晰。未見胃腸粘膜出血、潰瘍、增厚、淋巴濾泡增生等病變。觀察脾切面馬氏小體清晰可辨。睪丸、卵巢形態(tài)、大小正常。各實驗組動物的肝、腎、胃、腸、脾和卵巢、睪丸組織中，未見明顯異常。

2.3.5.2 臟器系數(shù)測定結(jié)果

由表12可見，肝、脾、腎、睪丸等臟器的重量和臟器系數(shù)與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。

2.3.5.3 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

大體觀察各試驗組動物的肝、腎、胃、腸、脾和卵巢/睪丸組織中，未見明顯異常。組織學(xué)檢查中，對照組和高劑量組少數(shù)動物的標(biāo)本出現(xiàn)病理改變，但這些病理改變程度較輕且無組間特異性分布，考慮與動物質(zhì)量有關(guān)，與對照組相比，不認(rèn)為實驗組出現(xiàn)有意義的病理改變。

3 結(jié)論

研究表明，蝙蝠蛾擬青霉菌粉為冬蟲夏草的菌株經(jīng)人工發(fā)酵獲得的冬蟲夏草真菌，即冬蟲夏草發(fā)酵菌絲粉（蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉paecilomyces hepiali chen），其化學(xué)成分與蟲草子實體中相應(yīng)的成分基本一致，主要腺苷、多糖、氨基酸、不飽和脂肪酸和金屬元素等?？飶┑耓6]等用冬蟲夏草水提取液對小鼠胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞以及脾細(xì)胞經(jīng)除去thy -1+細(xì)胞后殘存的細(xì)胞都有與劑量相關(guān)的致有絲分裂作用，說明蟲草對T和B淋巴細(xì)胞有增殖作用。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)三七中含有三七皂苷、三七素、黃銅、揮發(fā)油、氨基酸、糖類及各種微量元素等，三七苷為其主要活性成分之一。趙鵬、李彬[7]等探討三七皂甙對小鼠免疫功能的影響。結(jié)果顯示，三七皂甙能明顯刺激小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)化作用、促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)作用，提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)，提高小鼠的血清溶血素水平，促進(jìn)小鼠單核一巨嗜細(xì)胞碳廓清作用，增強(qiáng)小鼠的單核一腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬能力，提高小鼠NK細(xì)胞活性。枸杞子含有枸杞多糖、單糖、甜菜堿、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等多種化學(xué)成分，具有多種功效作用。王輝、白秀珍[8]研究枸杞煎劑對小白鼠免疫功能的作用。結(jié)果顯示，枸杞煎劑可明顯增加小白鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。紅景天主要化學(xué)成分有紅景天苷、黃酮類化合物、酚類化合物、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、微量揮發(fā)油及微量元素、氨基酸等。增強(qiáng)免疫力為其中功效之一。李立、王秋水[9]等探討紅景天提取物對小鼠免疫功能的影響。結(jié)果顯示，紅景天提取物可提高小鼠碳廓清能力;增強(qiáng)綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH能力，促進(jìn)NK細(xì)胞活性和血清凝血素的生成，增加抗體生成細(xì)胞數(shù)的生成，并且能提高小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力。絞股藍(lán)含有多種化學(xué)成分，如皂苷、氨基酸、糖類、甾醇、有機(jī)酸、微量元素、植物蛋白等。具有多種功效，增強(qiáng)免疫力為其中功效之一。周俐、葉開和[10]等探討絞股藍(lán)總苷免疫增強(qiáng)的藥理作用，結(jié)果顯示，絞股藍(lán)總苷可明顯的增強(qiáng)體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能。

金訶牌清瑞膠囊對小鼠經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均>20 g/kg-bw，屬于實際無毒物;Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗及精子畸形試驗結(jié)果均為陰性30d喂養(yǎng)大鼠對大鼠毛色、進(jìn)食、飲水、行為活動、生長發(fā)育、食物利用率、血液學(xué)指標(biāo)、血液學(xué)生化指標(biāo)均無明顯影響，解剖未見異常癥狀，肝體比、腎體比和脾體比與陰性對照組無顯著差異。結(jié)果表明金訶牌清瑞膠囊符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，是安全的保健食品。

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