吳清華，魏擔(dān)，梁穎，裴瑾，陳江，劉薇

桃仁為薔薇科植物桃Amygdaluspersica(L.)Batsch或山桃Amygdalusdavidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟種子，味甘、苦，性平，歸心、肝、大腸經(jīng)，有小毒，具有活血祛瘀，潤腸通便、止咳平喘的功效[1]，是常用活血化瘀中藥。桃仁的主要化學(xué)成分有脂質(zhì)(如中性脂、糖脂質(zhì)、磷脂)、苷類(苦杏仁苷、野櫻苷)、糖類(葡萄糖、蔗糖等)、蛋白質(zhì)、尿囊素酶等[2]。近年來，桃仁油即桃仁脂溶性成分的研究逐漸受到重視，藥材中的桃仁油含量為30～60%。采用GC-MS法對桃仁油分析表明，油中主要含有油酸（oleic acid）、亞油酸(linoleic acid)、棕櫚酸(n-hexadecanoic acid)、硬脂酸(octadecanoic acid)、苯甲醛(benzaldehyde)等化學(xué)成分[3]。桃仁、山桃仁化學(xué)成分研究較多，以脂肪酸、苦杏仁苷含量為評價指標(biāo)，兩者無明顯差異[4]。光桃仁作為市場上的主流品種之一，其化學(xué)成分研究暫無報道。安全、方便、快捷大規(guī)模提取桃仁油的方法亦無報道。桃仁油中油酸、亞油酸、棕櫚酸的含量測定方法較多，其樣品需進(jìn)行甲酯化處理或直接測定其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)[4～6]，而其他成分的含量未見報道。

角鯊烯是一種高度不飽和烴類化合物，于1906年在黑鯊魚肝油中分離得到，具有增強體質(zhì)、抗疲勞、抗腫瘤等作用，在功能性食品中廣泛應(yīng)用。角鯊烯在動物油脂中以鯊魚肝油含量最高，植物油中角鯊烯的皂化物較多，只有橄欖油和米糠油含量較多，目前提取角鯊烯通常采用富含此組分的大鯊魚肝為原料[7]。β-谷甾醇亦具有降脂、抗癌、抗炎、抗氧化等作用。故選擇β-谷甾醇和角鯊烯為桃仁指標(biāo)性成分，對桃仁藥材及桃仁油中β-谷甾醇、角鯊烯采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析并建立桃仁油的質(zhì)量評價方法。

1 儀器與材料

HH-S24S數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海君竺儀器制造有限公司)；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；SENCO R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)；Agilent1200型高效液相色譜儀；DAD二極管陣列檢測器；Agilent Chemstation色譜工作站。

家桃仁、山桃仁、光桃仁（產(chǎn)地、購買地見表1），經(jīng)裴瑾教授鑒定分別為薔薇科植物桃Amygdaluspersica(L.) Batsch、山桃Amygdalusdavidiana(Carr.) Franch.和光核桃(西藏桃)Amygdalusmira(Koehne) Yü et Lu 的干燥成熟種子；山桃仁壓榨油；β-谷甾醇(由四川維克生物科技有限公司提供，HPLC≥99%)；角鯊烯(由中國藥品生物制品檢定所提供，HPLC≥99%，批號：140721-200601)；自制重蒸水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-谷甾醇和角鯊烯HPLC含量測定

2.1.1 色譜條件的考察 通過對色譜條件系統(tǒng)性的考察，確定以下色譜條件最佳。色譜柱：迪馬C18柱（4.6mm×150mm，5μm）、迪馬C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇∶乙腈∶水(43∶55∶2)，流速1.0mL/min，檢測波長210nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量5μL，考察結(jié)果見表1。

表1 色譜條件考察結(jié)果表

圖1 β-谷甾醇、角鯊烯含量分析色譜條件考察

圖2 β-谷甾醇、角鯊烯含量分析色譜條件考察

圖3 β-谷甾醇、角鯊烯含量分析色譜條件考察

圖4 β-谷甾醇、角鯊烯含量分析色譜條件考察

圖5 β-谷甾醇、角鯊烯含量分析色譜條件考察

圖6 β-谷甾醇、角鯊烯含量分析色譜條件考察

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取桃仁粉末(過四號篩)5g，置圓底燒瓶(已稱重)中，加入50mL石油醚（60～90℃），80℃水浴回流60min，放冷，抽濾，取續(xù)濾液，50℃減壓回收石油醚，稱定重量，計算桃仁油得率；取桃仁油加乙腈、乙酸乙酯溶液（1∶2.5）溶解，并定容至10 mL，用0.45μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取一定量β-谷甾醇對照品溶液，加乙腈、乙酸乙酯溶液（1∶2.5）稀釋至一定濃度，搖勻，備用。分別精密吸取各濃度對照品溶液5μL進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo)，β-谷甾醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得β-谷甾醇濃度(y)和峰面積(x)的相關(guān)回歸方程：y=0.9633x+0.0969，R=0.9945，在0.518mg/mL～2.072mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

分別精密吸取一定量角鯊烯對照品溶液，加乙腈、乙酸乙酯溶液（1∶2.5）稀釋至一定濃度，搖勻，備用。分別精密吸取各濃度對照品溶液5μL進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo)，角鯊烯濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得角鯊烯濃度(y)和峰面積(x)的相關(guān)回歸方程：y=0.0834x-0.0211，R=0.9973，在0.033mg/mL～0.203mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取一定濃度的β-谷甾醇和角鯊烯混合對照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，計算RSD分別為0.35%、0.49%。

2.1.5 重復(fù)性試驗 精密稱定同一批次樣品溶液6份，按照2.1.2制備樣品溶液，進(jìn)樣5μL，測定β-谷甾醇和角鯊烯的峰面積，計算RSD分別為1.14%、1.72%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品溶液分別于0、2、6、12、24h進(jìn)樣5μL，測定β-谷甾醇和角鯊烯的峰面積，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.7 加樣回收試驗 精密稱定已知含量的樣品6份，加入適量β-谷甾醇和角鯊烯對照品，按照2.1.2制備樣品溶液，進(jìn)樣5μL，測定β-谷甾醇和角鯊烯的峰面積，計算平均加樣回收率和RSD分別為98.24%、1.34%，99.01%、1.56%。2.1.8 樣品中β-谷甾醇和角鯊烯的測定 以HPLC對18個批次不同品種、不同產(chǎn)地桃仁及桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7、圖8、表2。

圖7 桃仁中β-谷甾醇和角鯊烯的含量測定色譜圖

圖8 桃仁、桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量測定結(jié)果分析圖

表2 桃仁、桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量測定結(jié)果表

2.2 不同批次桃仁藥材及桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量

本實驗對18個批次不同品種、不同產(chǎn)地的桃仁藥材及桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量進(jìn)行了測定。18個批次藥材樣品中桃仁油的含量，無明顯的種間差異，平均含量為46.85%；藥材中β-谷甾醇和角鯊烯的含量亦無顯著種間差異，桃仁、山桃仁與光桃仁中，β-谷甾醇的平均含量分別為0.090%、0.098%、0.097%，角鯊烯的平均含量分別為0.015%、0.014%、0.014%；但同一品種不同批次藥材的含量差異較大。18個批次桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量亦無顯著種間差異，桃仁油、山桃仁油與光桃仁油中β-谷甾醇的平均含量分別為0.197%、0.198%、0.213%，角鯊烯的平均含量分別為0.032%、0.026%、0.030%。壓榨法提取桃仁油與索氏回流提取桃仁油中角鯊烯含量基本一致，表明壓榨法可有效提取桃仁中β-谷甾醇和角鯊烯。

2.3 桃仁藥材含量測定方法的建立

根據(jù)以上實驗結(jié)果建議：按桃仁干燥品計算，桃仁藥材含桃仁油不得少于37%，β-谷甾醇不得少于0.07%，角鯊烯不得少于0.01%；桃仁油含β-谷甾醇不得少于0.16%，角鯊烯不得少于0.02%。

3 討論

3.1 本研究結(jié)果表明，采用高效液相色譜法可有效測定桃仁藥材及桃仁油中β-谷甾醇和角鯊烯的含量，其色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇∶乙腈∶水(43∶55∶2)為流動相，檢測波長為210nm，流速1.0mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量5μL。同時，該色譜圖中其他8個色譜峰的分離度亦較好，對其進(jìn)行定性后，可對桃仁進(jìn)行更全面的質(zhì)量評價。

3.2脂溶性成分是種子類藥材的一類主要有效組分，其定量分析主要采用氣相色譜法。桃仁脂溶性成分的定量分析亦有報道，均采用氣相色譜法，且樣品需進(jìn)行甲酯化處理或直接測相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本實驗采用高效液相色譜法同時測定桃仁藥材中β-谷甾醇和角鯊烯的含量，方法簡便，可作為桃仁質(zhì)量評價方法之一，建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時，該色譜圖中其他8個色譜峰的分離度亦較好，對其進(jìn)行定性后，可對桃仁進(jìn)行更全面的質(zhì)量評價。

3.3 本實驗所用色譜條件檢測時間較長，指標(biāo)性成分色譜峰的保留時間均在44min后，采用多種方法進(jìn)行試驗，未得到有效地解決辦法。該色譜條件下存在大量其他色譜峰，可結(jié)合其他分析方法進(jìn)行定性分析，以更全面地評價桃仁藥材及桃仁油的質(zhì)量。通過對桃仁中脂溶性成分分析表明，桃仁油中含有大量的苯甲醛。苯甲醛為苦杏仁苷的水解產(chǎn)物之一，具有良好的抑菌和抗癌作用，也作食品添加劑使用。文獻(xiàn)報道表明可采用高效液相色譜法對苯甲醛進(jìn)行含量測定[8]。本實驗對桃仁油中苯甲醛進(jìn)行了定量分析，但由于苯甲醛在空氣中易被氧化成苯甲酸，其樣品溶液的制備存在一定難度，有待進(jìn)一步的改進(jìn)。

3.4 光桃仁基本作為山桃仁銷售使用，約占山桃仁總量的50%左右。1989年以來，光桃仁的資源報道較多，其資源豐富；另外，生長條件、豐產(chǎn)栽培技術(shù)、SRAP-PCR研究亦有報道，但藥理報道甚少，化學(xué)成分暫無報道。本研究對光桃仁脂溶性成分的含量、組成以及β-谷甾醇和角鯊烯的含量進(jìn)行了分析，并與家桃仁、山桃仁進(jìn)行比較分析，表明光桃仁與山桃仁差異較小，同時光桃仁資源豐富，可進(jìn)行深入的開發(fā)利用研究，擴大其使用。