魏琳顏，高霞，魏倩，張瑞萍，石影，鄭愛，薛紅麗

蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000

丙烯腈(acrylonitrile, ACN)是一種無色、苦杏仁味、易揮發(fā)的有機(jī)合成原料，在合成樹脂、纖維、橡膠等高分子材料中被廣泛使用[1]。ACN能通過消化道、呼吸道和皮膚等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，引起多個(gè)器官的病理改變。單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示25 mg·kg-1ACN亞慢性染毒可使大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞DNA含量及尾長顯著增加[2]。Li等[3]發(fā)現(xiàn)ACN可以通過破壞脂筏，引起B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤-10蛋白和脂筏分離，并通過抑制Ras-Raf-ERK通路引起免疫毒性。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，不僅參與機(jī)體免疫、炎癥、組織損傷修復(fù)和胚胎發(fā)育等過程，還可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[4]。NF-κB通常與其抑制劑IκB(inhibitor of nuclear factor kappa-B)結(jié)合，活性氧(reactive oxygen species, ROS)過量產(chǎn)生時(shí)激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)，進(jìn)而降解IκB蛋白[5]，然后NF-κB被游離出來而激活，激活后的NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮其生物活性作用[6]，其激活程度也可以被抗氧化劑所調(diào)節(jié)[7]。NF-κB還受IκB的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，因此NF-κB被活化后可以上調(diào)IκB的表達(dá)，這些新生成的IκB，一方面可與游離的NF-κB結(jié)合，重新使NF-κB的活性被抑制；另一方面，也可進(jìn)入細(xì)胞核向外輸出NF-κB的功能。研究發(fā)現(xiàn)，ROS激活的NF-κB信號通路能被N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)特異性地抑制[8]。脾是人體最大的外周免疫器官，脾臟在機(jī)體免疫、抗感染、血液濾過等方面起著重要作用。目前關(guān)于ACN對其他臟器毒性和機(jī)制的研究較多，而脾的研究資料較為缺乏。故本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠亞急性染毒ACN，觀察大鼠脾損傷的一般毒性表現(xiàn)，測定炎性因子，檢測NF-κB(p65)、IκB、p-IκB蛋白和基因表達(dá)水平變化，探討氧化應(yīng)激激活的NF-κB信號通路與ACN致大鼠脾損傷的關(guān)系，為進(jìn)一步研究ACN的脾臟毒性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑

ACN購于天津凱信(純度>99%)，NAC購于美國Amersco公司。p65兔抗大鼠一抗，IκB兔抗大鼠一抗，p-IκB兔抗大鼠一抗，HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗均購于美國CST公司，GAPDH一抗購于美國SAB公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購于美國SAB公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)測試盒均購于南京建成生物工程研究所，BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司。白介素6(IL-6)、白介素1-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒均購于Elabscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級健康成年SD雄性大鼠60只，體重180～220 g，購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號SCXK(甘)2015-0002)。隨機(jī)分為5組，每組12只，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證編號SYXK(甘)2015-0005)，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以11.5(低劑量組)、23.0(中劑量組)、46.0(高劑量組) mg·kg-1ACN、46.0 mg·kg-1ACN + 300 mg·kg-1NAC(NAC干預(yù)組)灌胃，NAC干預(yù)組NAC灌胃30 min后再灌ACN，對照組大鼠給予玉米油，1次/天，6天/周。染毒劑量主要依據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果和Abdel Naim[9]的研究設(shè)定，連續(xù)灌胃4周后處死大鼠。

1.3 脾臟器系數(shù)測定

末次染毒結(jié)束后，次日稱重。乙醚麻醉處死大鼠，分離大鼠脾并置于0.9%生理鹽水中，沖洗干凈，濾紙拭干后稱重并記錄。

1.4 氧化還原相關(guān)酶及炎性因子的測定

按照脾組織質(zhì)量(g)∶勻漿介質(zhì)(mL) =1∶9的質(zhì)量體積比加入適量預(yù)冷的0.9%的生理鹽水，冰浴研磨制成10%脾組織勻漿，轉(zhuǎn)速2 500 r·min-1離心10 min，取上清，嚴(yán)格按試劑盒說明書要求檢測SOD、MDA、GSH-Px、GSH、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、BCA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.5 Western Blot檢測脾組織NF-κB、IκB、p-IκB蛋白表達(dá)水平

每組隨機(jī)選取6只大鼠脾組織，稱取約90 mg，按組織質(zhì)量(mg)∶RIPA裂解液(mL)=1∶10的質(zhì)量體積比加入RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液，再按照PMSF(mL)∶RIPA(mL)=1∶100的體積比加入相應(yīng)體積的PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)，冰浴研磨，直至組織充分裂解。裂解后的樣品4 ℃、12 000 r·min-1，離心15 min，取上清，BCA法測定總蛋白，并按照比例加入RIPA稀釋液和5 ×SDS(sodium dodecyl sulfate)上樣緩沖液，沸水浴變性5 min，制得蛋白樣品。每條泳道加入60 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)彩虹marker標(biāo)識的目標(biāo)蛋白位置將目標(biāo)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST(Tris-buffered saline containing 0.1% Tween)室溫封閉1～2 h，放入GAPDH(1:5 000)、NF-κB (1:1 000)、IκB(1:1 000)、p-IκB(1:1 000)特異性抗體中4 ℃水平搖床過夜，TBST漂洗后室溫二抗(1:2 000)孵育2 h。加適量發(fā)光液后凝膠成像儀曝光，保存蛋白條帶，采用Image J圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量 =目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.6 Real Time PCR反應(yīng)檢測脾組織mRNA表達(dá)水平

每組隨機(jī)選取4只大鼠脾組織，取100 mg左右進(jìn)行Trizol一步法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得cDNA，以cDNA為模板，采用RT-PCR反應(yīng)檢測大鼠脾組織(β-actin、NF-κB、IκB)mRNA相對表達(dá)水平。采用25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中，第一步：預(yù)變性，95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步：共50個(gè)循環(huán)，95 ℃、5 s(變性)，55 ℃、30 s(退火)，72 ℃、30 s(延伸)；第三步：熔解反應(yīng)，60 ℃、15 s，71個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)表見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 大鼠脾濕重及臟器系數(shù)變化

單因素方差分析結(jié)果顯示，與對照組比較，ACN低、中劑量組大鼠脾濕重明顯降低(P<0.05)；ACN中劑量組大鼠脾臟器系數(shù)降低(P<0.05)。與高劑量組比較，NAC組大鼠脾濕重、臟器系數(shù)增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 大鼠脾組織脂質(zhì)過氧化指標(biāo)變化

與對照組相比，ACN中、高劑量組大鼠脾組織MDA含量增加(P<0.05)；高劑量組大鼠SOD、GSH-Px活力顯著增加(P<0.05)；低劑量組大鼠CAT活力顯著降低，高劑量組大鼠CAT活力顯著增加(P<0.05)；低劑量組大鼠GSH含量、T-AOC活力顯著降低(P<0.05)。與高劑量組比較，NAC組大鼠MDA含量、SOD活性、CAT活性、GSH含量、GSH-Px活性、T-AOC含量顯著降低(P<0.05)。

2.3 脾組織炎性因子水平變化

與對照組比較，ACN中、高劑量組大鼠脾組織內(nèi)IL-1β含量降低(P<0.05)，ACN各劑量組大鼠脾組織內(nèi)TNF-α含量增加(P<0.05)。與高劑量組比較，NAC組大鼠脾TNF-α含量降低(P<0.05)。

2.4 ACN染毒后大鼠脾組織NF-κB(p65)相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Western Blot結(jié)果示，ACN中、高劑量組大鼠脾NF-κB、IκB、p-IκB蛋白表達(dá)水平與對照組比較均升高(P<0.05)。NAC組大鼠脾IκB、p-IκB蛋白表達(dá)水平與ACN高劑量組比較降低(P<0.05)。

表2 大鼠脾濕重及臟器系數(shù)變化Table 2 Changes of the rats spleen wet weight and organ coefficient

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體重(g)×100。ACN表示丙烯腈，NAC表示N-乙酰半胱氨酸。

Note: compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6. organ coefficient (%)=wet weight of organ (g)/weight (g). ACN stands for acrylonitrile; NAC stands for N-acetylcysteine.

表3 大鼠脾組織脂質(zhì)過氧化指標(biāo)變化Table 3 Changes of lipid peroxidation index in rat spleen

注：MDA、SOD、CAT、GSH、GSH-Px、T-AOC表示丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力。與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: MDA, SOD, CAT, GSH, GSH-Px, T-AOC stand for malondialdehyde, superoxide dismutase, catalase, glutathione, glutathione peroxidase and total antioxidant capacity. Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

圖1 ACN染毒后NF-κB激活的免疫印跡分析注：A，Western Blot NF-κB、IκB、p-IκB蛋白條帶。B～D，Western Blot NF-κB、IκB、p-IκB蛋白條帶半定量分析。與對照組比較，* P<0.05；與高劑量組比較，# P<0.05；n=6。Fig. 1 Western Blot analysis on activation of NF-κB induced by ACNNote: A, Western Blot bands of NF-κB, IκB and p-IκB proteins; B～D, semi-quantitative analysis on Western Blot of NF-κB, IκB and p-IκB. Compared with control, * P<0.05; compared with high dose group, # P<0.05; n=6.

表4 脾組織炎性因子水平變化Table 4 Changes in the level of inflammatory factors in spleen tissue of rats

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

表5 ACN染毒后大鼠脾組織NF-κB(p65)相關(guān)蛋白表達(dá)變化Table 5 Changes of NF-κB (p65) related protein expression in rat spleen after ACN exposure

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

2.5 ACN染毒后大鼠脾NF-κB相關(guān)基因表達(dá)變化

RT-PCR結(jié)果顯示，ACN各劑量染毒組大鼠脾NF-κBmRNA表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)；ACN中、高劑量組大鼠脾IκBmRNA表達(dá)水平與對照組比較均升高(P<0.05)。NAC組大鼠脾NF-κBmRNA表達(dá)水平低于ACN高劑量組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

臟器系數(shù)能敏感地反映臟器受到毒物的毒性反應(yīng)，其數(shù)值大小的改變與臟器的損傷程度有明顯的相關(guān)關(guān)系[10]。正常狀態(tài)下，動(dòng)物各臟器的臟器系數(shù)比較固定，免疫器官的臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步觀察指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACN染毒后脾臟器系數(shù)減小，提示該組織可能出現(xiàn)了萎縮、退行性變化。

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化作用失衡的一種病理應(yīng)激狀態(tài)。GSH是非酶自由基清除劑，其含量常作為機(jī)體抗氧化能力大小的指標(biāo)之一[11]。本研究發(fā)現(xiàn)低劑量染毒組大鼠脾GSH含量顯著降低，可能是因?yàn)锳CN及其代謝產(chǎn)物2-氰環(huán)氧乙烷(CEO)與體內(nèi)GSH結(jié)合，使機(jī)體內(nèi)GSH含量下降。GSH-Px是一種含有巰基的重要的抗氧化酶，本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組大鼠脾組織GSH-Px活性顯著增加，可能是因?yàn)锳CN染毒后在其代謝過程中產(chǎn)生了過多的自由基，機(jī)體為了維持其本身的氧化-抗氧化之間的平衡狀態(tài)，代償性增高抗氧化酶GSH-Px。MDA含量多少與體內(nèi)細(xì)胞被破壞程度存在明顯的相關(guān)關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)中、高劑量染毒組大鼠脾MDA含量顯著升高，與黨瑜慧等[12]結(jié)論相似，提示ACN能夠引起脾脂質(zhì)過氧化損傷。SOD是生物體內(nèi)清除大量自由基的關(guān)鍵物質(zhì)，一旦SOD活性降低，積累過氧化氫，刺激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和氧化反應(yīng)來破壞細(xì)胞[13]，本研究結(jié)果顯示，高劑量組大鼠脾SOD活力升高，可能原因是ACN在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生大量·O2-，機(jī)體內(nèi)SOD升高清除·O2-來維持氧化-抗氧化平衡[14]。CAT是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，可減少體內(nèi)H2O2的積累，一旦CAT受到外源化學(xué)物的刺激，其反應(yīng)性會增加。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量組CAT活性顯著低于對照組，高劑量組CAT活性顯著高于對照組，提示低劑量染毒可使大鼠脾臟組織CAT活力降低，減弱了機(jī)體的抗氧化能力。T-AOC是機(jī)體防御體系之一，此種機(jī)能的降低常常導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量組大鼠脾組織T-AOC水平顯著降低(P<0.05)。此外，本研究中，與高劑量組相比，NAC組大鼠脾臟MDA、SOD、CAT、GSH、GSH-Px、T-AOC水平顯著降低，可能與NAC可以和活性氧直接發(fā)生作用，還可能與NAC能抑制ACN向其活性代謝產(chǎn)物CN-轉(zhuǎn)化及抑制ACN持續(xù)消耗ATP有關(guān)[15]。

IL-6是重要的促炎細(xì)胞因子，在炎性刺激下由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥免疫細(xì)胞分泌，其分泌水平可反映炎癥激烈程度。正常生理狀態(tài)下IL-6一般不表達(dá)，但在炎癥、病毒等刺激下分泌水平升高，呈高表達(dá)狀態(tài)。本研究中，與對照組比較，低、中、高劑量組大鼠脾組織內(nèi)IL-6含量增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-6有協(xié)調(diào)IL-1，誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成急性期反應(yīng)蛋白，可催化、放大炎性反應(yīng)及毒性作用，也可與TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成微循環(huán)障礙[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組IL-1β分泌水平顯著降低。此外，低、中、高劑量組TNF-α分泌水平顯著增加，表明ACN引起促炎因子TNF-α異常釋放。NAC干預(yù)后，大鼠脾TNF-α分泌水平顯著降低，說明NAC可使脾組織TNF-α表達(dá)降低，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用。

表6 ACN染毒后大鼠脾NF-κB相關(guān)基因表達(dá)變化Table 6 Changes of NF-κB related gene expression in rat spleen after ACN exposure

注：與對照組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05；n=6。

Note: Compared with control,*P<0.05; compared with high dose group,#P<0.05;n=6.

NF-κB信號通路可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并控制細(xì)胞凋亡、病毒復(fù)制、腫瘤發(fā)生、炎癥以及各種自身免疫性疾病[18]。同時(shí)，NF-κB信號通路在免疫、炎癥和腫瘤形成過程中還能協(xié)調(diào)、驅(qū)動(dòng)細(xì)胞活化和增殖[19]。NF-κB通常與其抑制因子IκB結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到上游刺激因子，如ROS、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、細(xì)菌脂多糖(LPS)等的作用時(shí)而激活[20-22]。NF-κB還可反饋調(diào)節(jié)，通過迅速合成IκB終止轉(zhuǎn)錄，維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定性[23]。Dang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ACN染毒后大鼠睪丸NF-κB蛋白相對表達(dá)量升高，經(jīng)NAC預(yù)處理后，NF-κB的活化受到抑制。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量染毒組大鼠脾NF-κB、IκB、p-IκB蛋白表達(dá)水平與對照組比較升高(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，低、中、高ACN染毒組大鼠脾NF-κBmRNA表達(dá)水平與對照組比較均升高(P<0.05)；中、高ACN染毒組大鼠脾IκBmRNA表達(dá)水平與對照組比較均升高(P<0.05)。可能是因?yàn)镹F-κB被活化后上調(diào)了IκB的表達(dá)，而IκB同時(shí)又被磷酸化。NAC組大鼠脾IκB、p-IκB蛋白表達(dá)水平與高ACN組比較降低(P<0.05)，NF-κBmRNA表達(dá)水平與高劑量組比較降低(P<0.05)，NF-κB的激活顯著受到抑制，這是因?yàn)镹AC作為一種有效的抗氧化劑，可以通過抑制氧化應(yīng)激，拮抗NF-κB的活化和其在核內(nèi)的表達(dá)[8]。提示ACN染毒后大鼠脾NF-κB信號通路的激活是由氧化應(yīng)激引起。

綜上所述，ACN亞急性染毒可對大鼠脾產(chǎn)生氧化損傷和免疫系統(tǒng)響應(yīng)，NAC可通過拮抗作用減輕大鼠脾損傷程度。