王應(yīng)軍，李娜，羅瀟宇，廖鑫

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，成都 611130 2. 四川雅安經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)規(guī)劃建設(shè)和安全生產(chǎn)環(huán)境保護(hù)局，雅安 625000

碳納米管(carbon nanotubes, CNTs)是一種處于納米尺度并具有新型結(jié)構(gòu)的晶體碳，是一種外圍由數(shù)十層的石墨烯片層架構(gòu)而成的中空碳管[1]。它通常被分為兩大類：?jiǎn)伪谔技{米管(single-walled carbon nanotubes, SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs)[2]。碳納米管擁有其他材料所無法達(dá)到的特殊性能，比如力學(xué)性能、導(dǎo)熱性能、導(dǎo)電性能以及化學(xué)和電化學(xué)性能等。這些卓越的材料性能正是建立在其本身所具有的獨(dú)特構(gòu)造，使其具有頗為廣闊的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景。但是，CNTs的生態(tài)系統(tǒng)潛在富集效應(yīng)、生物大分子的復(fù)合結(jié)合性、多種污染物聯(lián)合作用的復(fù)雜性、遷移和擴(kuò)散的傳播性會(huì)使其在更為廣闊的生境范圍中引起更加顯著的環(huán)境效應(yīng)[3]。

單細(xì)胞藻類作為水環(huán)境中的初級(jí)生產(chǎn)者，其生產(chǎn)量與種類的多樣性會(huì)直接影響到水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，并對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。納米材料在單細(xì)胞藻類體內(nèi)的積累和毒性，可以間接地影響到整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的平衡。CNTs具有十分獨(dú)特的材料性質(zhì)，在水體中的生態(tài)毒理效應(yīng)與其本身的環(huán)境行為密不可分[5]。但截至目前，CNTs對(duì)水生藻類植物的相關(guān)研究仍相對(duì)匱乏，大量的基礎(chǔ)性研究工作亟待開展[6]。已有少量研究報(bào)道CNTs可以對(duì)水生藻類植物造成毒害作用。多壁碳納米管在經(jīng)過適當(dāng)處理后可以顯著抑制和影響杜氏鹽藻的生長(zhǎng)，干擾胞內(nèi)光合作用PSII反應(yīng)進(jìn)程，影響胞內(nèi)抗氧化酶的活性狀態(tài)。這表明CNTs的確可以對(duì)藻類植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的毒性抑制作用，并推測(cè)CNTs團(tuán)聚形成的塊體是導(dǎo)致其毒性效應(yīng)的可能來源[7]。朱小山等[8]在用SWCNTs、MWCNTs和富勒烯處理斜生柵藻時(shí)，發(fā)現(xiàn)低濃度的碳管可以刺激藻的生長(zhǎng)，推斷藻的這種應(yīng)激反應(yīng)是其對(duì)抗環(huán)境脅迫和緩解CNTs毒性的可能原因。而Long等[9]和Mou等[10]在用不同濃度CNTs分別處理小球藻和斜生柵藻時(shí)同樣得出了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度的CNTs可以嚴(yán)重干擾藻細(xì)胞內(nèi)的生理生化狀態(tài)。比如：通過妨礙藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除代謝平衡，造成嚴(yán)重的細(xì)胞氧化損傷；通過對(duì)藻細(xì)胞的刺穿、割裂以及物理?yè)p傷，促使細(xì)胞凋亡；CNTs的團(tuán)聚現(xiàn)象可能影響藻細(xì)胞的光和代謝，導(dǎo)致遮光效應(yīng)，致使光合色素合成受阻；還包括與藻細(xì)胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)發(fā)生作用，使藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等的合成被抑制等。其他學(xué)者報(bào)告，SWCNTs可以強(qiáng)烈抑制萊茵衣藻與斜生柵藻的生長(zhǎng)[11]。

當(dāng)前，針對(duì)CNTs的相關(guān)環(huán)境行為以及生物效應(yīng)的研究已有少量報(bào)道，但對(duì)水生藻類植物的毒性效應(yīng)及其致毒機(jī)理的研究則非常有限。其次，CNTs在藻體內(nèi)必將引發(fā)生物累積以及生物毒性效應(yīng)，這將不可避免地對(duì)整個(gè)水生環(huán)境體系產(chǎn)生極為負(fù)面的作用和影響[9]。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)大型水體中的典型水華藻種，也是富營(yíng)養(yǎng)化水體和水華暴發(fā)的典型環(huán)境標(biāo)志物之一[12]；相比于其他微藻，銅綠微囊藻更能適應(yīng)氮磷比失調(diào)的水體、更能在實(shí)際水體環(huán)境中生存，故可做水生環(huán)境中初級(jí)生物的代表。本文采用標(biāo)準(zhǔn)的96 h短期毒性暴露試驗(yàn)方法，研究和評(píng)價(jià)MWCNTs單獨(dú)脅迫條件下對(duì)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生物毒性，深入分析其致毒機(jī)理，旨在為評(píng)價(jià)納米材料對(duì)水生環(huán)境中藻類的安全性和評(píng)估其對(duì)生物體的毒理學(xué)效應(yīng)提供更加科學(xué)全面的數(shù)據(jù)支持，為全面地反映真實(shí)水環(huán)境中多種納米材料共存的生態(tài)暴露風(fēng)險(xiǎn)提供參考依據(jù)，為開展生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及風(fēng)險(xiǎn)管理提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的MWCNTs購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，多壁碳納米管粒徑<8 nm，純度大于95%，長(zhǎng)度均為<30 μm。具體性質(zhì)如表1所示。

取MWCNTs適量，均勻分散于盛有適量稀硝酸的250 mL錐形瓶中，靜置48 h，去除制備MWCNTs過程中混進(jìn)的一些金屬離子。將懸浮液在10 000 r·min-1條件下離心10 min，棄上清液，用去離子水反復(fù)沖洗沉淀、離心，至上清液pH=7為止。處理后MWCNTs于烘箱內(nèi)烘干，即得純化MWCNTs。稱取純化MWCNTs適量于BG-11培養(yǎng)基中，攪拌24 h使其充分分散，制成濃度為5 mg·mL-1的MWCNTs懸浮液母液。待母液滅菌后封口保存，使用前將其超聲分散30 min，以使MWCNTs均勻分散。BG11培養(yǎng)基配方如Wu等[13]在其文獻(xiàn)中所述。

本實(shí)驗(yàn)選用的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)株系來自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種庫(kù)(FACHB)。嚴(yán)格按照無菌操作的要求，轉(zhuǎn)接時(shí)藻液∶培養(yǎng)基體積比為1∶2。放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，周期為12 h晝12 h夜，每天定時(shí)搖瓶3次。培養(yǎng)2周后觀察，如生長(zhǎng)較好，再進(jìn)行轉(zhuǎn)接，比例為1∶5至1∶6，反復(fù)接種，使之處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本文參照OECD 201藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)方法，將銅綠微囊藻接種在滅菌后的三角錐形瓶中，其初始接種藻密度為10×105cells·mL-1，再分別加入定量MWCNTs母液，使最終實(shí)驗(yàn)濃度為0、0.1、0.5、1、5、10、50和100 mg·L-1，在光照度3 000～4 000 lux、光周期12 h Light/12 h Dark的光照培養(yǎng)箱中暴露96 h。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3平行。

1.2.1 藻細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定

藻細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定依據(jù)李娟等[14]的方法并進(jìn)行改進(jìn)：取一定量的實(shí)驗(yàn)藻液，用分光光度計(jì)測(cè)定其在680 nm處吸光度值，扣除含有相同濃度的納米碳管懸浮液在680 nm的吸光度值，通過查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取實(shí)驗(yàn)樣品的藻細(xì)胞密度。

1.2.2 葉綠素a含量的測(cè)定

取3 mL試驗(yàn)樣品，8 000 r·min-1離心3 min。倒掉上清液，加入同體積的丙酮(80%)。放入4 ℃冰箱中下靜置24 h。離心后取樣于663 nm和450 nm處測(cè)定吸光度。依據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

Chl-a mg·L-1=12.72×OD663-2.7×OD450

1.2.3 藻細(xì)胞組織液的提取

取20 mL藻樣，8 000 r·min-1條件下離心10 min收集藻細(xì)胞。用等滲緩沖液(PBS，0.1 mol·L-1, pH=7.4)反復(fù)離心并收集藻細(xì)胞數(shù)次。加入緩沖液PBS并使用液氮研磨，使藻細(xì)胞充分破碎。之后轉(zhuǎn)入離心管中定容至3 mL，即藻細(xì)胞組織液提取完成。該液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

1.2.4 組織液指標(biāo)的測(cè)定

SOD、POD、CAT活力，MDA、蛋白質(zhì)含量均采用試劑盒測(cè)定，測(cè)試方法依次為黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)[15]、比色法[16]、可見光法[17]、硫代巴比妥酸(TBA)法[18]、考馬斯亮藍(lán)法[19]。以上試劑盒均購(gòu)置于南京建成生物工程研究所。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Office Excel 2010軟件進(jìn)行處理和繪圖，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析及t檢驗(yàn)，置信水平選取0.95，當(dāng)P>0.05代表差異不顯著，P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 MWCNTs對(duì)藻生長(zhǎng)的影響

在相同的時(shí)間內(nèi)，低濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)處理組藻細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對(duì)照組(0 mg·L-1)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯升高。96 h時(shí)，0.1 mg·L-1處理組藻細(xì)胞數(shù)顯著高于72 h處理組(P<0.05)，而0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1各處理組在相同時(shí)間內(nèi)藻細(xì)胞數(shù)差異并不顯著(P>0.05)。在前72 h內(nèi)，各中濃度(1.0 mg·L-1, 5.0 mg·L-1和10 mg·L-1)處理組與空白對(duì)照組(0 mg·L-1)生長(zhǎng)狀況相似，相同時(shí)間內(nèi)并無顯著差異(P>0.05)。而96 h后，各處理組藻細(xì)胞數(shù)開始逐漸下降。在相同的時(shí)間內(nèi)，10 mg·L-1處理組藻細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對(duì)照組(0 mg·L-1)18.2%(P<0.05)，表明此時(shí)藻細(xì)胞受到了生長(zhǎng)抑制，而5.0 mg·L-1處理組卻略微升高，比1.0 mg·L-1處理組略高10.1%(P>0.05)。當(dāng)培養(yǎng)至96 h，大量納米管懸浮液由于凝聚作用慢慢沉降，培養(yǎng)環(huán)境中的碳管濃度逐漸變小，這對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)自然具有一定的刺激作用。當(dāng)脅迫濃度為高濃度(50 mg·L-1和100 mg·L-1)時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)全程受到抑制。10 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1各處理濃度在96 h的抑制率分別是18.18%、35.45%和71.68%。經(jīng)線型擬合，其規(guī)律符合方程y=0.209x-0.424，R2=0.87，擬合效果良好。

表1 多壁碳納米管性質(zhì)Table 1 The properties of multi-walled carbon nanotubes

注：CVD表示化學(xué)氣相沉積法。

Note: CVD stands for chemical vapor deposition; MWCNT stands for multi-walled carbon nanotubes.

2.2 MWCNTs對(duì)葉綠素a含量的影響

光合色素是藻類進(jìn)行光合作用重要的組成部分，是一類能夠反應(yīng)藻類生長(zhǎng)過程中利用光能力的重要物質(zhì)。藻類植物通過光合作用，把二氧化碳和水轉(zhuǎn)化成儲(chǔ)存著的能量和有機(jī)物，并且在這個(gè)化學(xué)過程中釋放出氧氣，供其他生物呼吸。因而，它也是決定藻細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖最重要的生理基礎(chǔ)。光合色素含量的高低不僅可以用來指示藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，還能夠暗示藻體受到環(huán)境脅迫的程度。如圖2所示，96 h時(shí)不同濃度的MWCNTs對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響，與藻細(xì)胞生長(zhǎng)變化趨勢(shì)基本表現(xiàn)一致。從圖中可以看出，在低濃度(0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1)處理組，各處理組內(nèi)葉綠素a含量差異顯著(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，MWCNTs處理組各葉綠素a含量基本保持一致，并有略微升高。其中0.5 mg·L-1處理組葉綠素a含量高達(dá)52.02 mg·L-1，比對(duì)照組升高9.61%，達(dá)到最大值。這表明低濃度MWCNTs處理刺激了藍(lán)藻中葉綠素a的合成。隨著濃度的進(jìn)一步升高，在中濃度(1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1)處理組范圍內(nèi)，各處理的的葉綠素含量開始大幅下降，明顯低于空白對(duì)照組。當(dāng)處理濃度到達(dá)50 mg·L-1和100 mg·L-1時(shí)，各處理組葉綠素a合成受到嚴(yán)重抑制，其抑制率竟高達(dá)85.1%。而相同濃度內(nèi)，各組含量差異并不顯著(P>0.05)，并隨濃度升高無顯著變化(P>0.05)。這表明在高濃度MWCNTs的環(huán)境脅迫下，藍(lán)藻生長(zhǎng)狀況惡劣。胞內(nèi)生理代謝紊亂，藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素a合成嚴(yán)重受阻，藻細(xì)胞內(nèi)光合作用受到嚴(yán)重傷害。

圖1 不同濃度的碳納米管對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響注：小寫字母相同，代表相同時(shí)間內(nèi)，數(shù)據(jù)差異不顯著；小寫字母不同，代表相同時(shí)間內(nèi)，數(shù)據(jù)差異顯著；大寫字母相同， 表示相同濃度條件下，不同時(shí)間組間差異不顯著；大寫字母不同，表示相同濃度條件下，不同時(shí)間組間差異顯著。Fig. 1 Effects of MWCNTs on the growth of M. aeruginosaNote: The same lowercase letters, representing the data difference is not significant at the same time; different lowercase, representing the data significant differences at the same time; the same capital letters, indicating that significant differences were not observed in different time groups under the same dose level; different capital letters, indicating that significant differences were observed in different time groups under the same dose level.

圖2 不同濃度的多壁碳納米管對(duì)銅綠微囊藻 葉綠素a含量的影響注：小寫字母相同，表示不同濃度組間差異不顯著；小寫字母不同， 表示不同濃度組間差異顯著。Fig. 2 Effects of MWCNTs on chlorophyll a content of M. aeruginosaNote: The same lowercase letters indicate there is no significant difference among different concentration groups; different lowercase letters indicate there are significant differences among different concentration groups.

圖3 不同濃度的多壁碳納米管對(duì)銅綠微囊藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：小寫字母相同，表示不同濃度組間差異不顯著； 小寫字母不同，表示不同濃度組間差異顯著。Fig. 3 Effects of MWCNTs on superoxide dismutase (SOD) activity of M. aeruginosaNote: The same lowercase letters indicate there is no significant difference among different concentration groups; different lowercase letters indicate there are significant differences among different concentration groups.

圖4 不同濃度的多壁碳納米管對(duì)銅綠微囊藻 過氧化物酶(POD)活性的影響注：小寫字母相同，表示不同濃度組間差異不顯著； 小寫字母不同，表示不同濃度組間差異顯著。Fig. 4 Effects of MWCNTs on peroxidase (POD) activity of M. aeruginosaNote: The same lowercase letters indicate there is no significant difference among different concentration groups; different lowercase letters indicate there are significant differences among different concentration groups.

2.3 MWCNTs對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

藻類組織細(xì)胞中含有的活性氧(ROS)，比如超氧陰離子等超氧化物，能夠?qū)υ寮?xì)胞產(chǎn)生氧化威脅或氧化損傷，并干擾藻細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。而作為發(fā)揮關(guān)鍵作用的抗氧化酶類(如SOD)能及時(shí)消滅這類有害的自由基，保護(hù)藻細(xì)胞免受氧化所傷。因而，藻體中的SOD活性的變化情況，可以指示CNTs對(duì)銅綠微囊藻造成的氧化壓力的程度。如圖3可知，低濃度(0.0～0.5 mg·L-1)處理組中，MWCNTs各處理組比對(duì)照組都有略微升高，在0.5 mg·L-1處達(dá)到最大值17.23 U·(108cells)-1，高于空白對(duì)照14.1%，但差異變化并不顯著(P>0.05)。這說明，在低濃度范圍內(nèi)，CNTs對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生了氧化脅迫，超氧陰離子等氧自由基開始大量生成。藻細(xì)胞為了免受氧化脅迫，誘導(dǎo)合成大量的抗氧化劑以清除超氧化物，這導(dǎo)致SOD合成量上升。而隨著處理濃度繼續(xù)增高，處理組SOD開始明顯下降(P<0.05)，當(dāng)處理濃度到達(dá)至高濃度時(shí)(50 mg·L-1和100 mg·L-1)，SOD活性受到嚴(yán)重抑制，各組間并無顯著性差異(P>0.05)。這表明高濃度的MWCNTs會(huì)嚴(yán)重妨礙抗氧化酶系正常的功能。此時(shí)抗氧化體系遭受崩潰，藻細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化損傷效應(yīng)。

2.4 MWCNTs對(duì)過氧化物酶(POD)活性的影響

藻細(xì)胞中的活性氧自由基除超氧化物外，還包括H2O2等過氧化物。藻細(xì)胞中這類自由基累積和代謝失衡，會(huì)對(duì)藻細(xì)胞中的細(xì)胞器或細(xì)胞膜等發(fā)生過氧化反應(yīng)，造成胞內(nèi)嚴(yán)重的氧化脅迫和氧化損傷。而POD可以及時(shí)清除這類活性氧，維持細(xì)胞內(nèi)正常的代謝平衡。與SOD的作用相類似，藻細(xì)胞中POD活性的強(qiáng)弱可以間接反映胞內(nèi)活性氧的代謝強(qiáng)度。如圖4所示，藻細(xì)胞POD活性表現(xiàn)為先上升再下降的變化趨勢(shì)。低濃度(<1.0 mg·L-1)處理時(shí)，藻細(xì)胞的POD活性都有小幅的升高。在0.10 mg·L-1處藻細(xì)胞的POD活性達(dá)到最大值，為1.77 U·(108cells)-1，與空白對(duì)照組相比差異并不顯著(P>0.05)。這表明，在合適的低濃度范圍內(nèi)，MWCNTs可以誘導(dǎo)藻細(xì)胞中的過氧化氫等自由基含量上升，也有可能是因?yàn)榇藭r(shí)大量的SOD參與抗氧化反應(yīng)，導(dǎo)致超氧化物的歧化產(chǎn)物H2O2大量積累。藻細(xì)胞為了抵抗MWCNTs逐漸形成的氧化脅迫，分泌或合成更多的POD以去除過量的過氧化物。伴隨著處理濃度繼續(xù)升高，當(dāng)超過1.0 mg·L-1時(shí)各組的POD活性均開始大幅下降。在中濃度(1.0～5.0 mg·L-1)處理范圍內(nèi)，各組與對(duì)照組相比基本一致(P>0.05)。這表明此時(shí)的藻細(xì)胞自身的生理代謝開始受到CNTs的影響，藻細(xì)胞遭受氧化脅迫，過氧化物自由基的清除速率開始降低。

2.5 MWCNTs對(duì)過氧化氫酶(CAT)活性的影響

與POD的作用類似，CAT也可以及時(shí)清除藻細(xì)胞內(nèi)的H2O2，避免藻細(xì)胞遭受過氧化損傷。CAT活性的強(qiáng)弱可以在一定程度上指示藻細(xì)胞受到的氧化脅迫水平。如圖5所示，MWCNTs濃度高于0.1 mg·L-1，CAT活性均隨處理濃度的升高呈現(xiàn)持續(xù)降低的變化趨勢(shì)，表明藻細(xì)胞持續(xù)受到H2O2的過氧化壓力，且氧化脅迫程度隨濃度的升高而逐步升高。低濃度時(shí)(<0.50 mg·L-1)，各組CAT活性與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)處理濃度升高至中濃度范圍內(nèi)時(shí)(1.0～10.0 mg·L-1)，各組的下降幅度開始加大。而高濃度(50～100 mg·L-1)時(shí)，各處理組CAT活性受到嚴(yán)重抑制，與POD活性的變化趨勢(shì)相吻合，說明藻細(xì)胞受到的氧化傷害加劇，胞內(nèi)抗氧化體系失衡或崩潰。

圖5 不同濃度的多壁碳納米管對(duì)銅綠微囊藻 過氧化氫酶(CAT)活性的影響注：小寫字母相同，表示不同濃度組間差異不顯著； 小寫字母不同，表示不同濃度組間差異顯著。Fig. 5 Effects of MWCNTs on catalase (CAT) activity of M. aeruginosaNote: The same lowercase letters indicate there is no significant difference among different concentration groups; different lowercase letters indicate there are significant differences among different concentration groups.

2.6 MWCNTs對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響

當(dāng)藻細(xì)胞中的ROS等物質(zhì)攻擊細(xì)胞器膜和細(xì)胞質(zhì)膜，會(huì)與其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜正常功能被破壞。產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物——丙二醛又可與其他生物大分子發(fā)生作用，比如和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使其功能喪失等，嚴(yán)重干擾細(xì)胞內(nèi)的正常生理代謝進(jìn)程。因而MDA含量的多少可以反映藻細(xì)胞受到CNTs的氧化損傷程度。由圖6可知，各處理組的MDA含量均隨處理濃度的升高而明顯上升。在低濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)時(shí)，各組MDA含量與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。這表明低濃度CNTs造成的氧化脅迫比較輕微，藻細(xì)胞通過及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的各種活性氧物質(zhì)，使細(xì)胞生理代謝水平運(yùn)轉(zhuǎn)正常，尚未遭受嚴(yán)重的氧化傷害。當(dāng)處理濃度超過50.0 mg·L-1時(shí)，各組含量基本維持不變，此時(shí)MDA含量約為空白對(duì)照組含量的4倍左右(P<0.05)。這表明活性氧累積水平如此之高并超過了藻細(xì)胞所能承受的范圍，通過加劇膜脂質(zhì)過氧化傷害，藻細(xì)胞的正常生理代謝水平崩潰，藻體受到嚴(yán)重氧化損傷。MDA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果意味著CNTs對(duì)藻細(xì)胞的生物毒性，與通過加劇胞內(nèi)氧化脅迫傷害具有十分緊密的聯(lián)系。

圖6 不同濃度的多壁碳納米管對(duì)銅綠微囊藻 丙二醛(MDA)含量的影響注：小寫字母相同，表示不同濃度組間差異不顯著； 小寫字母不同，表示不同濃度組間差異顯著。Fig. 6 Effects of MWCNTs on malondialdehyde (MDA) content of M. aeruginosa Note: The same lowercase letters indicate there is no significant difference among different concentration groups; different lowercase letters indicate there are significant differences among different concentration groups.

2.7 MWCNTs對(duì)可溶性蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)是組成生命有機(jī)體的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，是維持植物細(xì)胞開展正常生命活動(dòng)的重要生物大分子。藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的高低可以揭示其受到納米碳管的脅迫狀況。如下表2所示，MWCNTs實(shí)驗(yàn)組銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的含量，呈現(xiàn)出先上升后下降的變化走向，在低濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)時(shí)，各處理組與空白對(duì)照組相比，蛋白質(zhì)含量無明顯差異(P>0.05)。之后隨著處理濃度升高至中濃度(1.0～5.0 mg·L-1)范圍，蛋白含量開始顯著上升(P<0.05)。當(dāng)5.0 mg·L-1時(shí)，MWCNTs達(dá)到最大值55.48 μg·(106cells)-1，并顯著高于空白對(duì)照組74.1%(P<0.05)。這說明中低濃度范圍內(nèi)，MWCNTs可以促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，以抵抗納米碳管帶來的環(huán)境脅迫。而隨著處理濃度的進(jìn)一步升高，當(dāng)處理濃度超過10.0 mg·L-1時(shí)，蛋白含量均出現(xiàn)急劇下降。

3 討論(Discussion)

本研究中，銅綠微囊藻在MWCNTs單一脅迫條件下表現(xiàn)出較好的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。低濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)的處理并沒有對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)，相反表現(xiàn)出刺激生長(zhǎng)的現(xiàn)象。Mou等[10]在用不同類型不同長(zhǎng)度的CNTs處理斜生柵藻(S.obliquus)時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)暴露濃度處于一定的低濃度范圍時(shí)，CNTs會(huì)對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生刺激作用。這種刺激反應(yīng)很可能是當(dāng)藻細(xì)胞受到CNTs脅迫時(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)某些酶活性提高，同時(shí)胞內(nèi)相關(guān)代謝加強(qiáng)，為了適應(yīng)和對(duì)抗脅迫環(huán)境，藻體促進(jìn)并提高了自身的繁殖能力和代謝水平[20]。本研究中當(dāng)處理濃度為高濃度(50 mg·L-1、100 mg·L-1)時(shí)，所有藻細(xì)胞生長(zhǎng)都受到強(qiáng)烈的抑制作用。這很有可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中大量的CNTs團(tuán)聚沉降，大量藻細(xì)胞聚集，使得藻細(xì)胞間競(jìng)爭(zhēng)以及生存環(huán)境惡化。同時(shí)大量的處于納米尺度級(jí)別的CNTs還可能會(huì)刺穿團(tuán)聚的藻細(xì)胞，造成細(xì)胞變形、質(zhì)壁分離、細(xì)胞質(zhì)外流和細(xì)胞凋亡等接觸物理?yè)p傷[21]。這又進(jìn)一步阻礙和破壞藻細(xì)胞內(nèi)正常的生理生化代等謝過程，最終嚴(yán)重抑制了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表2 多壁碳納米管對(duì)銅綠微囊藻類蛋白質(zhì)含量的影響Table 2 Effects of MWCNTs on protein content of M. aeruginosa

注：小寫字母相同，表示不同濃度組間差異不顯著；小寫字母不同，表示不同濃度組間差異顯著。

Note: The same lowercase letters indicate there is no significant difference among different concentration groups; different lowercase letters indicate there are significant differences among different concentration groups.

光合作用是藻類植物開展生命活動(dòng)必不可少的生理基礎(chǔ)，藻類植物通過光合作用，吸收并轉(zhuǎn)化光能為化學(xué)能，從而用于自身的生長(zhǎng)和繁殖。葉綠素a可以吸收和轉(zhuǎn)化光能為電能，是最為重要的一種光合色素，葉綠素a的含量多少可以直接衡量藻細(xì)胞光合作用的效率，還可以間接指示藻細(xì)胞生長(zhǎng)和生命活動(dòng)的狀態(tài)。有研究表明，CNTs在植物葉綠體內(nèi)會(huì)被吸附、聚集并被轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜表面，在與葉綠體的相互接觸過程中，光合活性會(huì)被增高數(shù)倍[22]；牟鳳偉[23]在研究CNTs對(duì)斜生柵藻(S.obliquus)生理影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，中濃度CNTs會(huì)使藻細(xì)胞的光合色素含量有所升高。而本研究同樣得出了相似的結(jié)果：低濃度CNTs會(huì)使葉綠素a的含量有所升高。這很有可能是低濃度污染物脅迫條件下，藍(lán)藻細(xì)胞做出的應(yīng)激反應(yīng)，通過提高光合作用過程中電子傳遞閾值，從而積極影響電子轉(zhuǎn)運(yùn)，并最終促進(jìn)了電子傳遞效率的提高，還有可能是藻細(xì)胞的抗氧化防御體系受到影響[24]，即通過加強(qiáng)藻細(xì)胞內(nèi)的光合作用以及活性氧的清除，來抵御外界環(huán)境脅迫。這與之前關(guān)于銅綠微囊藻生長(zhǎng)量的研究結(jié)果一致。高濃度的CNTs會(huì)嚴(yán)重抑制3種光合色素的合成，導(dǎo)致藻細(xì)胞的光合作用被嚴(yán)重干擾和破壞，這很有可能是由于CNTs本身的不透光性所引起的。當(dāng)大量的碳納米顆粒吸附并團(tuán)聚在藻細(xì)胞周圍時(shí)，藻細(xì)胞可利用的光能急劇減弱，即CNTs的遮光效應(yīng)嚴(yán)重阻礙了藻細(xì)胞的光合作用。碳納米顆粒由于其本身處于納米尺度的原因，具有相當(dāng)復(fù)雜的結(jié)合特性。它也可能會(huì)直接進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)，割裂諸如葉綠體等細(xì)胞器造成機(jī)械損傷，細(xì)胞被刺穿或分解，進(jìn)而阻礙了相關(guān)光合色素的合成[25]。Long等[9]在用CNTs處理小球藻時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，CNTs的遮光效應(yīng)所引起的藻細(xì)胞的毒性可以高達(dá)總毒性的五分之一左右，藻因?yàn)椴荒苓M(jìn)行光合作用，導(dǎo)致其無法正常的生長(zhǎng)和繁殖。由于CNTs還可以在水中會(huì)產(chǎn)生活性氧，當(dāng)大量的自由基進(jìn)攻藻細(xì)胞以及葉綠體時(shí)，膜系統(tǒng)將會(huì)受到嚴(yán)重的氧化傷害，這也會(huì)導(dǎo)致其藻細(xì)胞的生理代謝功能紊亂，藻細(xì)胞凋亡機(jī)制啟動(dòng)，導(dǎo)致藻體開始程序性死亡，引發(fā)葉綠體結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，甚至解體，最終光合色素被降解[26]。

當(dāng)藻體遭受外界環(huán)境中的毒物脅迫時(shí)，藻細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生各種氧自由基，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等，它們會(huì)對(duì)藻體產(chǎn)生相當(dāng)嚴(yán)重的氧化脅迫和損傷。而藻細(xì)胞為了維持正常的生理代謝環(huán)境，自身具有一套完整的抗氧化防御體系，使得細(xì)胞內(nèi)的各種活性氧自由基的發(fā)生與消滅通常處于動(dòng)態(tài)穩(wěn)定中。藻細(xì)胞中的抗氧化系統(tǒng)一般包含酶系和非酶系統(tǒng)等兩大類抗氧化物質(zhì)。而SOD、POD和CAT作為抗氧化酶系中的關(guān)鍵酶類，可以通力協(xié)作及時(shí)消滅細(xì)胞中的O2-、H2O2，在維持細(xì)胞自由基代謝平衡，避免遭受氧化損傷等方面發(fā)揮著巨大的作用[14]。在本研究中，低濃度的CNTs引起SOD、POD等抗氧化酶的升高，表明藻細(xì)胞體內(nèi)有ROS累積和升高。為了對(duì)抗CNTs造成的輕微環(huán)境脅迫，細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除代謝水平也得以提高，這可以理解成藻體的一種氧化應(yīng)激反應(yīng)，與藻的生長(zhǎng)刺激效應(yīng)，光合水平的增高等生理代謝過程具有緊密的聯(lián)系。與此同時(shí)，由于自身獨(dú)特的光反應(yīng)特性，CNTs在水體環(huán)境中可以直接產(chǎn)生活性氧。當(dāng)這些ROS裹挾著納米碳粒，既可以通過與細(xì)胞膜的直接物理接觸發(fā)生作用，也能夠在水體直接攻擊藻細(xì)胞而施加更為嚴(yán)重的氧化壓力。當(dāng)ROS的生成量和攻擊程度超過了藻細(xì)胞的可以正常處理的閾值范圍時(shí)，CAT的活性開始明顯下降。細(xì)胞中原先的超氧化物被SOD陸續(xù)催化，并反應(yīng)生成大量的H2O2。由于抗氧化體系逐漸崩潰，過氧化物無法及時(shí)清除而開始大量積累。最終，過量的H2O2致使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量驟然上升，藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，膜功能運(yùn)作嚴(yán)重受阻，藻細(xì)胞正常的生理代謝活動(dòng)被嚴(yán)重干擾和破壞。有研究報(bào)道，當(dāng)藻細(xì)胞被CNTs穿透、割裂、刺穿，造成物理接觸損傷時(shí)，同樣可能引起氧化損傷[27]。

蛋白質(zhì)是植物體關(guān)鍵的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是生命體細(xì)胞結(jié)構(gòu)重建與細(xì)胞間信號(hào)溝通的重要的生物大分子，參與藻細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)。它還作為細(xì)胞中各類酶類物質(zhì)重要組成成分而存在，因而對(duì)胞內(nèi)的生命代謝進(jìn)程所產(chǎn)生的影響和作用十分巨大。有研究報(bào)道，低濃度的CNTs能夠引起藻細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量應(yīng)急性升高，而高濃度時(shí)則會(huì)嚴(yán)重抑制斜生柵藻胞內(nèi)蛋白的合成[23]。本研究同樣得出了類似的結(jié)果：當(dāng)CNTs濃度低于5.0 mg·L-1時(shí)，銅綠微囊藻可溶性蛋白含量會(huì)隨處理濃度的升高而明顯升高。并且該現(xiàn)象與藻藍(lán)蛋白含量的變化趨勢(shì)具有一定的相關(guān)性。這很可能是中低濃度的CNTs促進(jìn)了藻細(xì)胞內(nèi)的各種合成代謝。通過刺激合成光合色素，提高了藻細(xì)胞開展光合作用的效率，同時(shí)也為分泌蛋白提供了必要的原料和能量。蛋白質(zhì)含量的上升使藻細(xì)胞得以抵抗CNTs所引起的環(huán)境脅迫，而隨著處理濃度的繼續(xù)升高，蛋白含量急劇下降。這可能是因?yàn)樵弩w受到的氧化壓力在不斷增強(qiáng)，藻細(xì)胞內(nèi)大量的活性氧自由基積累，并進(jìn)攻氨基酸殘基，蛋白水解酶被激活，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能失活或者被降解[25]。與此同時(shí)，不斷進(jìn)入藻細(xì)胞的CNTs可能會(huì)與胞內(nèi)生物大分子發(fā)生作用，可能會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的變性或水解。當(dāng)胞內(nèi)相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯的路徑被干擾時(shí)，胞內(nèi)蛋白的含量自然會(huì)下降，這些最終促使銅綠微囊藻的生長(zhǎng)被強(qiáng)烈抑制。聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組的蛋白含量表現(xiàn)為不斷下降，并未有上升的跡象，這可能與其CNTs的聯(lián)合作用機(jī)制密切相關(guān)，但具體原因尚不清楚，仍需進(jìn)一步的研究和論證。