肖潤梅，肖晨曦

（1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430015；2.武漢大學 生命科學院，湖北武漢 430072）

細胞色素P450（cytrochrome P450，CYP450）是肝臟進行Ⅰ相生物轉(zhuǎn)化的主要酶系[1-3]。對該酶的誘導或抑制可導致與其聯(lián)用的藥物清除率和毒性改變[4-6]。檳榔是僅次于酒精、煙草和咖啡，被廣泛使用的習慣性嗜好品，世界上約10%的人在使用它[7-8]。檳榔中含有多種嘧啶生物堿，檳榔堿占總生物堿的0.30%～0.63%[9-10]。檳榔堿對CYP450酶活性的影響未見報道，探討檳榔堿對肝臟代謝功能的影響，在藥理學、毒理學研究中有重要意義[11-13]。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

氫溴酸檳榔堿（arecoline hydrobromide，AH）（上海阿拉丁試劑，批號：20140618，含量≥98%），6β-羥基睪酮、安非他酮、羥基安非他酮對照品購自美國Cayman Chemical公司，睪酮和甲苯磺丁脲（德國Dr.Ehrenstorfer公司），4-羥基甲苯磺丁脲、6-羥基氯唑沙宗和去甲基右美莎芬購自加拿大TRC公司，混合人肝微粒體（human liver microsome，HLM）（美國BD Gentest公司），右美莎芬（加拿大Toronto Research Chemicals Inc公司），非那西?。ㄉ虾lfa Aesar公司），對乙酰氨基酚（日本TCI公司），BCA蛋白試劑盒（美國Thermo Scientific公司），乙腈和甲醇色譜純（德國Merck公司）。

1.2 實驗儀器

HPLC-20A高效液相色譜儀、LC-MS-8040三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀購自日本島津公司，Vortex-5型漩渦震蕩器（天津儀器廠），BP211D電子天平（德國Sartorius公司），5417 R小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），P型移液器（法國Gilson公司）。

1.3 探針底物與肝微粒體溫孵反應條件

以探針底物在HLM溫孵體系中對應特征代謝物的生成量，評價各種CYP450亞型酶的活性，并在本實驗室現(xiàn)有基礎上優(yōu)化反應條件[14]。本實驗探針底物的濃度選擇參考文獻[7-8]，其濃度值均在其表觀Km值附近。各探針底物在HLM中的最佳溫孵反應條件見表1。

1.4 探針底物代謝物的檢測

CYP3A4、2E1、1A2、2C9探針底物代謝物的色譜檢測在柱溫25℃，進樣量60μl條件下進行，其他檢測條件見表2。CYP2D6、CYP2B6探針底物代謝物的色譜檢測在柱溫40℃，流速0.2 ml/min，進樣量10μl條件下進行線性梯度洗脫；質(zhì)譜條件：霧化器3 L/min，干燥氣15.0 L/min，離子噴霧電壓4.5 kV，碰撞氣壓力230 kPa，DL管溫度和加熱模塊溫度分別為250和400℃，進樣量10μl；掃描方式為多反應檢測；其他檢測條件見表3。

表1 探針底物在HLM中的最佳溫孵反應條件

1.5 代謝物含量測定的方法學考察

分別對 CYP1A2、2E1、3A4、2C9、2D6、2B6 6種亞型酶的特異性代謝產(chǎn)物的專屬性、線性、回收率和精密度測定進行方法學考察。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 CYP3A4、2E1、1A2、2C9探針底物代謝物的檢測條件

表3 CYP2D6、2B6探針底物代謝物的檢測條件

2 結(jié)果

2.1 專屬性

實驗得到各代謝產(chǎn)物的專屬性色譜分離圖（空白肝微粒體溫孵液對照組色譜圖、各探針底物的特異性代謝產(chǎn)物標準品溶液色譜圖，以及各探針底物經(jīng)肝微粒體代謝后產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的色譜圖）。實驗結(jié)果表明，各代謝產(chǎn)物測定專屬性良好，代謝產(chǎn)物峰無明顯干擾。見圖1。

圖1 加入不同探針底物的HLM孵育體系

2.2 線性范圍、精密度和回收率

HLM各代謝產(chǎn)物的標準曲線、精密度和相對回收率見表4。在檢測范圍內(nèi)，各代謝產(chǎn)物檢測方法準確度較高，檢測精密度良好。

2.3 AH對HLM中CYP450酶活性的影響

與對照組比較，CYP1A2、2E1、3A4、2C9、2D6、2B6 6種CYP450亞型的酶活性出現(xiàn)輕微抑制現(xiàn)象，抑制現(xiàn)象隨著AH濃度的升高而增強，當濃度達到160μmol/L時，HLM中CYP3A4、2D6、2B6、2E1、1A2和2C9的酶活性分別降低17.6%、36.2%、38.3%、35.0%、14.6%和 35.4%。見圖2。

表4 HLM各代謝產(chǎn)物的標準曲線、精密度和相對回收率

圖2 AH對HLM中CYP450酶活性的體外影響

3 討論

目前，已確定人類CYP450基因有18個家族、44個亞家族，已有57種人類CYP450酶亞型被克隆和確認[9]，尤其是肝臟中的CYP2D6、2C、1A2、2E1、2B6、3A4，分別占 1.0%、20.0%、120.%、6.0%、0.2%～6.0%和29.0%人肝總量，分別參與30%、17%、4%、2%、2%～10%和50%藥 物 代謝[10]。實驗發(fā)現(xiàn)中、低劑量（80和40μmol/L）AH對體外HLM中6種CYP450亞型酶活性僅有極弱抑制作用，且抑制作用隨AH濃度的升高而增強。當AH為160μmol/L時，對HLM中CYP2D6、2B6、2E1和2C9酶活性的抑制率分別為36.2%、38.3%、35.0%和35.4%。體外HLM孵育結(jié)合混合探針底物法測定酶活性是一個常用的評價藥物對CYP450酶抑制作用的方法[11]。HLM的實驗結(jié)果比動物肝微粒體更接近人體內(nèi)實驗，體外研究不僅能提供各CYP450酶對底物藥物的代謝狀況，而且可以排除體內(nèi)其他因素的干擾，具有明確、高通量、操作簡便等優(yōu)點，在為整體實驗提供理論依據(jù)方面具有較大優(yōu)勢。但是體外實驗的結(jié)果在選擇探針底物的種類和濃度、受試物濃度設定、酶蛋白濃度，以及微粒體來源等因素方面有可能受到影響，不同實驗的結(jié)果可能會有一定的差異[12]，因此在討論藥物可能存在的基于CYP450酶代謝相互作用風險時，應當結(jié)合體內(nèi)實驗進行評價。本實驗提示，中、低劑量組咀嚼檳榔可能不會造成嚴重代謝相互作用。本實驗室前期研究表明，灌胃AH能誘導大鼠肝臟CYP2E1的體內(nèi)活性，但隨口服AH劑量增加，出現(xiàn)不同程度的抑制，且抑制作用隨AH濃度的升高而增強[13]，與本實驗高劑量組結(jié)果一致。古桂花等[14]從病理學及細胞生物學的角度探討檳榔堿對小鼠肝細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)檳榔堿組的肝細胞及其周邊有炎癥，嚴重的還會導致細胞凋亡。肝臟是藥物代謝的主要器官，這可能是檳榔嗜好者使用CYP1A2、2E1、3A4、2C9、2D6、2B6 6個CYP450亞型酶的底物藥物時，存在代謝相互作用的風險，其具體機制有待進一步研究。

[1] LYNCH T, PRICE A. The effect of cytochrome P450 metabolism on drug response, interactions, and adverse effects[J]. Am Fam Physician, 2007, 76(3): 391-396.

[2] WANG B, YANG S, HU J, et al. Multifaceted interaction of the traditional Chinese medicinal herb schisandra chinensis with cytochrome P450-mediated drug metabolism in rats[J].Ethnopharmacol, 2014, 155(3): 1473-1482.

[3] 謝海棠, 賈元威, 譚志榮, 等, 豆腐果苷對人肝微粒體CYP450酶體外抑制作用研究[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2011, 31(17):1404-1407.

[4] 冷欣夫, 邱星輝. 細胞色素P450酶系的結(jié)構、功能與應用前景[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

[5] MüLLER D J, BRANDL E J, HWANG R, et al. The AmpliChip?CYP450 test and response to treatment in schizophrenia and obsessive compulsive disorder: a pilot study and focus on cases with abnormal CYP2D6 drugmetabolism[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2012, 16(8): 897-903.

[6] 石亮, 張遠冬, 王二豪, 等. 沒食子酸及其氧化產(chǎn)物對大鼠肝微粒體CYP3A的抑制效應[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2014, 36(2):130-134.

[7] GUPTA P C, WARNAKULASURIYA S. Global epidemiology of areca nut usage[J]. Addict Biol, 2002, 7(1): 77-83.

[8] TSAI J F, CHUANG L Y, JENG J E. et al. Betel quid chewing as a risk factor for hepatocellular carcinoma: a case-control study[J]. Br J Cancer, 2001, 84(5): 709-713.

[9] YANG X, ZHANG B, MOLONY C, et al. Systematic genetic and genomic analysis of cytochrome P450 enzyme activities in human liver[J]. Genome Res, 2010, 20(8): 1020-1036.

[10] WARREN B L, BELLWARD G D. Cytochrome P450 dependent biotransformation: some recent developments concluding remarks: the multiplicity of cytochromes P-450[J]. Proc West Pharmacol Soc, 1980(23): 7-9.

[11] UTSUNOMIYA H, TILAKARATNE W M, OSHIRO K, et al.Extracellular matrix remodeling in oral submucous fibrosis: its stage-specific modes revealed by immuuohisto chemistry and in situhybfidization[J]. Oral Pathol Med, 2005, 34(8): 498-507.

[12] TSAI C H, YANG S F, LEE S S, et al. Augmented heme oxygenase-1 expression in areca quid chewing-associated oral submucousfibrosis[J]. Oral Dis, 2009, 15(4): 281-286.

[13] TILAKARATNE W M, KLINIKOWSKI M F, SAKU T, et al. Oral submucous·fibrosis: review on aetiology and pathogenesis[J].Oral Oncol, 2005, 42(6): 561-568.

[14] 古桂花, 曾薇, 胡虹. 檳榔粗提物及檳榔堿對小鼠肝細胞凋亡的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2013, 29(2): 56-58.