趙龍，王寧，石曉嵐，劉翠翠

（陜西省西安市兒童醫(yī)院 呼吸哮喘科，陜西 西安 710003）

支氣管哮喘疾病是由多種炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞，以及多種細(xì)胞因子作用于肺氣道的常見慢性疾病[1-2]。調(diào)查顯示，近年全球兒童哮喘發(fā)病率持續(xù)上升[3]。血清類黏蛋白1樣蛋白3（orosomucoid1-like protein 3，ORMDL3）基因位于17q21，被MOFFATT等[4]首次發(fā)現(xiàn)并確定為兒童哮喘新的候選基因，此后集中于兒童哮喘的研究[5]。大量研究顯示，ORMDL3轉(zhuǎn)基因小鼠能夠增加氣道重塑和氣道反應(yīng)等重要的哮喘病理特征，而該過程可能與microRNA（miRNA）的調(diào)控關(guān)系密切[6-7]。miRNA是一種非編碼短鏈RNA，可調(diào)控多種生物學(xué)過程[8]。研究顯示，大量miRNA對(duì)哮喘疾病引起的氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMC）和肥大細(xì)胞異常增殖具有調(diào)節(jié)作用，如miR-10a和miR-133a通過調(diào)控其靶基因影響ASMC的增殖[9-10]。miR-34a可參與調(diào)節(jié)多種平滑肌細(xì)胞增殖[11]。SHIN等[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)基因TSC1通過抑制miR-34a水平參與調(diào)控哮喘疾病，然而miR-34a對(duì)ASMC增殖的調(diào)控仍然未知。本文旨在探索miR-34a對(duì)ASMC增殖和ORMDL3表達(dá)水平的調(diào)控效應(yīng)及機(jī)制，為哮喘發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年雌性小鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無特定病原體級(jí)別，SCXK（滬）2015-0001]，ASMC（美國Cambrex Bioscience公司），卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁 Al（OH）3購自美國 Sigma公司，miR-34a-mimic、miR-34a-mimic購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，壓縮式霧化吸入器（德國PARI有限公司），MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（美國Trevigen公司），Dharma FECT 1 Transfection Reagent（美國 Thermo Scientific公司），MTT試劑（廣州新視野生物科技有限公司），miR Neasy mini試劑盒、miScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Qiagen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Clontech公司），SYBR Green Master Mix（美國生命國際科技有限公司），聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒、anti-ORMDL3、anti-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制與分組

小鼠體重22～38 g，共90只進(jìn)行OVA誘導(dǎo)，復(fù)制哮喘模型[13]。動(dòng)物處理分為4組：①OVA組（30只）注射后1、7和14 d每只小鼠左下腹腔注射2.5 mg Al（OH）3+25μg OVA的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（250μl），21 ～ 27d用100ml 2%OVA進(jìn)行氣道霧化；②對(duì)照組（15只）1、7和14 d每只小鼠左下腹腔注射250μl PBS；③miR-34amimic組（30只）基礎(chǔ)處理同模型組，并于21～27 d左下腹腔注射50 nmol/50μl miR-34a-mimic，1次/d；④miR-34a-mimic-NC組（15只）左下腹腔注射50 nmol/50μl miR-34a-mimic-NC，1次 /d。

1.3 蘇木精-伊紅染色

取28 d小鼠肺組織固定于10%多聚甲醛，用石蠟包埋，制作石蠟切片，厚5μm，用常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并觀察肺部氣道組織病理學(xué)改變。

1.4 ASMC培養(yǎng)

ASMC的培養(yǎng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將凍存的ASMC細(xì)胞于37℃溫水浴融化進(jìn)行復(fù)蘇。500 r/min離心5 min，加10 ml含1%青鏈霉素、1%谷氨酰胺、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并置于37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔3 d換液1次，待細(xì)胞生長至融合率達(dá)80%后用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代，用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 MicroRNA寡核苷酸的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

ASMC按2×107個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，細(xì)胞融合率達(dá)60%時(shí)，使用Dharma FECT 1試劑盒轉(zhuǎn)染25 nmol miR-34a-mimic或者對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組miR-34a-mimic-NC處理72 h，隨后用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)miR-34a的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.6 ASMC增殖實(shí)驗(yàn)

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度為5×103個(gè)/孔。細(xì)胞在接受轉(zhuǎn)染后的72 h進(jìn)行MTT試劑孵育，孵育條件為37℃、4 h。隨后加入二甲基亞砜溶解形成的甲瓚，使用Aspectrophotometer系統(tǒng)檢測(cè)490 nm下的吸光值。

1.7 qRT-PCR

細(xì)胞或者組織進(jìn)行裂解后，使用miR Neasy mini試劑盒抽提總RNA，抽提過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成mRNA。用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成miRNA。采用SYBR Green Master Mix對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。采用GAPDH對(duì)mRNA的相對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用U6對(duì)miRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，表達(dá)水平相對(duì)倍數(shù)關(guān)系和顯著性分析用2-ΔΔCt法計(jì)算。見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測(cè)

對(duì)28 d大鼠氣道組織或被轉(zhuǎn)染72 h的ASMC使用裂解緩沖液（0.5% v/v Nonidet P-40，50）進(jìn)行裂解，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)，并且統(tǒng)一濃度為6μg/μl。用10μl蛋白進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離后用聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)。37℃、5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗（anti-ORMDL3，1∶600）孵育，4℃過夜。用TBST清洗3次，10 min/次。PVDF膜經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶18 000）室溫孵育1.5 h，使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行曝光。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件（美國Media Cybernetics公司）測(cè)量光密度，并使用內(nèi)參蛋白GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVA誘導(dǎo)氣道平滑肌層異常增殖

首先觀察OVA對(duì)肺部結(jié)構(gòu)的影響，HE染色結(jié)果表明，OVA誘導(dǎo)雌性小鼠的肺部結(jié)構(gòu)改變明顯。對(duì)照組肺部結(jié)構(gòu)正常，平滑肌層厚度均勻，上皮細(xì)胞排列整齊。OVA組結(jié)果顯示，氣道平滑肌層加厚，上皮細(xì)胞排列紊亂，肺部結(jié)構(gòu)明顯異常。表明OVA可誘導(dǎo)小鼠氣道組織平滑肌層異常增生。見圖1。

2.2 OVA誘導(dǎo)氣道組織ORMDL3表達(dá)上調(diào)并抑制miR-34a水平

ORMDL3在哮喘中扮演重要角色，第28天，OVA組ORMDL3 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（4.562±0.481）和（4.064±0.598），對(duì)照組ORMDL3 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.001±0.249）和（0.999±0.140），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.104和12.224，均P=0.000），與對(duì)照組比較OVA組ORMDL3的相對(duì)表達(dá)上調(diào)。見圖2。

通過生物信息學(xué)分析，初步篩選并檢測(cè)在第28天可能調(diào)控ORMDL3表達(dá)的9種miRNA，包括miR-1、miR-20、miR-34a、miR-34b-5p、miR-34c、miR-106a、miR-133a、miR-302及miR-449。OVA組miR-34a表達(dá)水平與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），OVA組低于對(duì)照組。而OVA組miR-1、miR-20、miR-34b-5p、miR-34c、miR-106a、miR-133a、miR-302及miR-449的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖3。

2.3 miR-34a-mimic減少氣道平滑肌層的增殖與ORMDL3的高表達(dá)

將焦點(diǎn)放在被OVA顯著抑制的miR-34a，從第21天開始連續(xù)7 d在左下腹腔注射miR-34a-mimic，HE染色觀察小鼠氣道組織變化。與miR-34a-mimic-NC組相比，miR-34a-mimic組小鼠氣道平滑肌層的異常增殖明顯減緩。見圖4。

圖1 小鼠肺組織 （HE×400）

圖2 氣道組織中ORMDL3的表達(dá)變化 （n =6，±s）

表2 OVA與對(duì)照組小鼠氣道組織中miRNA的表達(dá)水平比較 （n =6，±s）

表2 OVA與對(duì)照組小鼠氣道組織中miRNA的表達(dá)水平比較 （n =6，±s）

組別 miR-1 miR-20 miR-34a miR-34b-5p miR-34c miR-106a miR-133a miR-302 miR-449對(duì)照組 1.001±0.013 1.000±0.108 1.000±0.051 1.000±0.121 1.000±0.064 1.000±0.093 1.001±0.086 1.000±0.048 1.001±0.039 OVA 組 1.264±0.281 1.021±0.253 0.188±0.121 1.011±0.012 0.983±0.110 1.252±0.229 1.137±0.117 0.992±0.131 1.044±0.134 t值 1.294 0.043 -12.619 0.027 -0.435 2.017 1.795 -0.02 0.057 P值 0.225 0.981 0.000 0.994 0.983 0.071 0.103 0.985 0.956

圖3 氣道組織中miRNA的相對(duì)水平變化（n =6，±s）

對(duì)照組、OVA組、miR-34a-mimic-NC組 及miR-34a-mimic組的ORMDL3 mRNA表達(dá)量分別為（1.002±0.132）、（6.242±0.705）、（6.120±0.146）和（2.810±0.249），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=488.606，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-28.089，P=0.000）；而OVA組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.415，P=0.687）。因此，ORMDL3的高水平表達(dá)可被miR-34a-mimic減弱。見圖5。

圖4 miR-34a過表達(dá)處理的肺組織 （HE×400）

對(duì)照組、OVA組、miR-34a-mimic-NC組 及miR-34a-mimic組的ORMDL3蛋白表達(dá)量分別為（1.001±0.012）、（5.238±0.217）、（5.481±0.852）和（1.983±0.113），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.350，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-9.969，P=0.000）；而OVA組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.677，P=0.514）。結(jié)果表明，ORMDL3的高水平表達(dá)可被miR-34a-mimic減弱。見圖5。

圖5 各組氣道組織中ORMDL3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

2.4 miR-34a-mimic抑制ASMC活性與ORMDL3的表達(dá)

體外培養(yǎng)ASMC細(xì)胞并轉(zhuǎn)染miR-34a-mimic或miR-34a-mimic-NC，測(cè)得對(duì)照組、miR-34amimic組及miR-34a-mimic-NC組的miR-34a相對(duì)表達(dá)水平分別為（1.004±0.183）、（8.315±0.282）和（1.002±0.092），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1322.616，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組分別與對(duì)照組、miR-34amimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=53.271和60.389，均P=0.000）；而對(duì)照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.024，P=0.981）。表明miR-34a-mimic成功使miR-34a過表達(dá)。見圖6。

對(duì)照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34amimic組490 nm下的吸光值分別為（1.347±0.132）、（1.363±0.047）和（0.794±0.053），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.103，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組分別與對(duì)照組和miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.523和19.675，均P=0.000）；而對(duì)照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.280，P=0.785）。因此，miR-34a可抑制ASMC細(xì)胞490 nm下的吸光值。見圖6。

對(duì)照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34amimic組的細(xì)胞活性率分別為（100.034±2.582）、（100.243±9.251）和（68.982±13.243）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.785，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組分別與對(duì)照組和miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.637和4.740，均P=0.000）；而對(duì)照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.053，P=0.959）。結(jié)果表明，miR-34a可抑制ASMC細(xì)胞的活性。見圖6。

在培養(yǎng)的ASMC中，對(duì)照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34a-mimic組的ORMDL3 mRNA表達(dá)水平分別為（0.998±0.123）、（1.131±0.082） 和（0.232±0.101），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2328.823，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組分別與對(duì)照組和miR-34amimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.789和16.927，均P=0.000）；而對(duì)照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.204，P=0.052）。因此，miR-34a可以抑制ASMC的增殖活性，并下調(diào)ORMDL3基因的表達(dá)。見圖7。

在培養(yǎng)的ASMC中，對(duì)照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34a-mimic組的ORMDL3蛋白表達(dá)水平分別為（1.001±0.032）、（1.014±0.053）和（0.254±0.006），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=876.739，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，miR-34a-mimic組分別與對(duì)照組和miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=56.201和34.902，均P=0.000）；而對(duì)照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.514，P=0.618）。結(jié)果表明，miR-34a可以抑制ASMC的增殖活性，并下調(diào)ORMDL3基因的表達(dá)。見圖7。

圖6 miR-34a-mimic抑制ASMC增殖 （n =6，±s）

圖7 各組ASMC細(xì)胞中ORMDL3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

ASMC的功能性失調(diào)是支氣管哮喘的關(guān)鍵因素，對(duì)該功能失調(diào)的內(nèi)在分子與細(xì)胞機(jī)制仍無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能調(diào)控ORMDL3基因表達(dá)并參與介導(dǎo)哮喘ASMC功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OVA誘導(dǎo)和刺激下小鼠的氣道組織中miR-34a的表達(dá)下降。以往研究表明，miRNA可通過自身水平的改變，參與哮喘動(dòng)物模型氣道和平滑肌層功能的調(diào)控，miR-10a可以通過調(diào)控其靶基因PI3KCA促進(jìn)ASMC增殖[9]，miR-133a通過調(diào)節(jié)靶向調(diào)控IL-13，從而影響Ras同源基因家族成員A（ras homolog gene family member A，RhoA）的表達(dá)，并且RhoA的表達(dá)增加能夠參與平滑肌的收縮調(diào)節(jié)[10]。miR-1在肌肉生理功能中扮演重要角色。研究表明，下調(diào)miR-1可以調(diào)節(jié)哮喘疾病過程中的平滑肌肥大[14]。miR-155敲除小鼠表現(xiàn)出迅速地氣道重塑和平滑肌細(xì)胞中的膠原沉積[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA誘導(dǎo)的小鼠氣道組織中miR-1、miR-133a有微弱上調(diào)趨勢(shì)。但是引人注目的是，miR-34a表達(dá)下調(diào)明顯，說明在哮喘小鼠氣道組織中miR-34a可能具有潛在調(diào)控作用。大量研究表明，miR-34a可調(diào)控多種細(xì)胞功能，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力[16]，以及平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力[11]。另外SHIN等[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)基因TSC1通過抑制miR-34a水平參與調(diào)控哮喘疾病，并顯著抑制肥大細(xì)胞的增殖和活力。與上述結(jié)果一致，本研究的結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-34a可抑制哮喘小鼠氣道平滑肌層的異常增殖和ASMC的增殖。以上結(jié)果說明，miR-34a能夠在包括哮喘在內(nèi)的多種病理過程中，抑制多種細(xì)胞的增殖和活力。

自首次報(bào)道后，ORMDL3被大量用于兒童期哮喘疾病的研究，ORMDL3亦可在胎兒及成人的組織中表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠哮喘模型中過表達(dá)ORMDL3，可增加哮喘氣道組織病理性重塑，包括平滑肌細(xì)胞增殖增加、上皮下纖維化及黏液分泌加重[7]。TONCHEVA等[17]發(fā)現(xiàn)，ORMDL家族基因，包括ORMDLL1、ORMDL2及ORMDL3在哮喘患者平滑肌細(xì)胞中明顯上調(diào)，然而單核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，ORMDL3是其中最主要的影響因素。本研究獲得類似的結(jié)果，即在OVA的誘導(dǎo)下，ORMDL3在氣道組織的表達(dá)上調(diào)。然而，該上調(diào)趨勢(shì)被過表達(dá)miR-34a抑制。近年來大量研究表明，miRNA可通過抑制靶基因直接或間接調(diào)控各種蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮不同的生理功能[8]，且miRNA參與調(diào)控哮喘引起的ASMC增殖等過程與ORMDL3的功能密不可分[7，18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的ASMC中miR-34a過表達(dá)可抑制ORMDL3的表達(dá)。以上結(jié)果表明，在體內(nèi)外的ASMC中，ORMDL3水平均可被miR-34a抑制。

綜上所述，過表達(dá)miR-34a可緩解哮喘小鼠ASMC異常增殖和抑制ORMDL3的高表達(dá)；另外miR-34a可抑制AMSC細(xì)胞的增殖，并且降低AMSC中ORMDL3水平。結(jié)果表明，哮喘致氣道平滑肌層功能異常的內(nèi)在機(jī)制可能與miR-34a調(diào)節(jié)ORMDL3水平變化相關(guān)。然而，miR-34a是否對(duì)ORMDL3進(jìn)行直接調(diào)控，仍需進(jìn)一步深入研究。

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