鄭昕蕊，劉婉婷，王婷婷，孫麗娟，呂瑩，楊瑞，于麗

（濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東省神經(jīng)疾病與再生修復(fù)重點實驗室，濰坊261053 ）

快速城市化和工業(yè)化導(dǎo)致能源消耗和污染物排放量急劇增加?？諝馕廴疚镏械闹饕泻Τ煞质穷w粒物（particulate matter, PM），尤其是細顆粒物（空氣動力學(xué)直徑＜2.5 μm，PM2.5），其主要化學(xué)組分包括無機硝酸、硫酸鹽、有機化合物、元素碳及粉塵等五類物質(zhì)，與嚴重空氣污染引發(fā)的健康威脅密切相關(guān)，PM2.5對人體的危害遠遠大于粗顆粒[1-3]。由于胚胎期對外界環(huán)境刺激較出生后更為敏感，相較于出生后PM2.5暴露，妊娠期PM2.5暴露對子代生長發(fā)育的影響更為明顯[4-5]。課題組前期實驗表明妊娠期暴露在PM2.5環(huán)境中可導(dǎo)致子代鼠出現(xiàn)腦損傷，并引起細胞凋亡[6]。凋亡相關(guān)基因p53和c-Fos是否參與此過程，機制尚不明確。因此本實驗選用妊娠期PM2.5暴露的子代鼠作研究對象，通過對大腦皮層部位凋亡相關(guān)基因p53和c-Fos表達的檢測，進一步探討妊娠期PM2.5暴露導(dǎo)致子代大腦皮層損傷的分子機制，從而為評價妊娠期空氣污染物暴露引起胎兒神經(jīng)發(fā)育異常的風(fēng)險提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 PM2.5懸濁液的制備

利用大氣顆粒物采樣器采取某地級市城區(qū)2016年12月至2017年3月間暖季的大氣細顆粒物PM2.5。PM2.5樣品的制備方法參考課題組前期的研究[6]

2 動物分組和造模

SPF級昆明小鼠，8～9周齡，體重32～38g,按 2∶1雌雄比合籠，次日查出陰栓者記為妊娠第1d。將孕鼠隨機分為空白組、 PBS 對照組、 PM2.5低、中、高劑量組，每組6只。參照課題組前期方法[7]，從妊娠期第1d開始，每3d在PM2.5模型組使用氣管滴注改良法滴注 PM2.5懸濁液 30 μl（低劑量組 0.2592μg/μl、中劑量組1.56695μg/μl、高劑量組3.456μg/μl），PBS對照組滴注相同劑量PBS緩沖液，空白組不做任何處理，整個孕期共7次。本實驗過程合理使用實驗動物，并經(jīng)過動物倫理委員會批準。

3 熒光定量PCR技術(shù)檢測p53和c-Fos mRNA表達

采用Trizol試劑提取出生后14d子代鼠大腦皮層組織總RNA。測RNA濃度，根據(jù)RNA濃度進行定量。用PCR儀按說明書進行cDNA反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板， PCR分別擴增β-actin、p53、c-Fos，反應(yīng)體系為10×PCR Buffer，dNTP，RNase和反轉(zhuǎn)錄酶。采用SYBR染料法反應(yīng)體系，即SYBR和上、下游引物，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析。各引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of the primers for RT-qPCR

4 Western blot檢測p53和c-Fos表達

分離出生后14d子代鼠大腦皮層組織，將組織勻漿后4℃ 12000 r/min離心15min，留上清，測蛋白濃度。將20μg蛋白組織進行電泳、轉(zhuǎn)膜，PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉2小時后根據(jù)需要裁膜，分別放入抗體工作液稀釋的鼠抗p53（1∶ 200，美國Cell Signaling Technology 公司）和兔抗 c-Fos（1∶ 300，美國Cell Signaling Technology 公司）中4℃冰箱孵育過夜，再分別用TBST稀釋的羊抗鼠IgG（1∶ 2000，美國Proteintech公司）和羊抗兔IgG（1∶ 1000，美國 Proteintech公司）孵育1h，在暗室進行曝光顯影定影。

5 免疫熒光染色檢測p53和c-Fos的表達分布

子代鼠出生后第14d，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.9% NaCl和4%多聚甲醛全身灌注，完整剖取鼠腦；將鼠腦依次放入4℃ 30%、25%、20%蔗糖梯度脫水；冰凍切片，切片厚度15μm，-20 ℃保存；復(fù)溫后進行抗原修復(fù)，待室溫冷卻后10%羊血清封閉1 h，再分別加入鼠抗p53（1∶ 200，美國Cell Signaling Technology 公司）、兔抗 c-Fos（1∶ 50，美國Cell Signaling Technology 公司），37℃烤箱孵育0.5h后放于4℃冰箱過夜，避光加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶200，美國Millipore 公司）或TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶ 200，美國Millipore 公司），37℃烤箱孵育50min后用Hoechst（1∶ 1000）染色于37℃烤箱孵育20min，抗熒光衰減封片劑進行封片，熒光顯微鏡觀察并拍照，Image-Pro Plus軟件分析，每組取5張切片，每張切片取5個視野進行熒光強度分析。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差表示。多組間的比較用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α = 0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 妊娠期PM2.5暴露導(dǎo)致子代鼠大腦皮層c-Fos表達增多

Western blot分析顯示，與對照組相比，PM2.5低劑量組子代鼠大腦皮層c-Fos蛋白表達略增多，但無統(tǒng)計學(xué)意義，PM2.5中、高劑量組c-Fos蛋白表達明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A、B）。熒光定量RT-PCR檢測顯示，與對照組相比，PM2.5中、高劑量組子代鼠大腦皮層c-Fos mRNA表達明顯增多（圖1C）。子代鼠大腦皮層額葉區(qū)免疫熒光染色和免疫熒光強度定量分析顯示，c-Fos在正常細胞中在細胞核和細胞質(zhì)同時表達，而在PM2.5模型組幾乎在細胞質(zhì)表達，c-Fos陽性細胞主要分布在額葉區(qū)皮層的錐體細胞層、內(nèi)顆粒層和節(jié)細胞層（Ⅲ-V層）；c-Fos免疫反應(yīng)性隨PM2.5濃度增加而增強，對照組與空白組相比，c-Fos免疫反應(yīng)性無差別，與對照組相比，PM2.5低、中、高劑量組c-Fos免疫反應(yīng)性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A、B）。c-Fos表達與PM2.5濃度呈劑量依賴關(guān)系，而正常皮層組織中c-Fos表達較低。

圖1 高劑量PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層c-Fos表達增強。 A，c-Fos表達水平的Western blot檢測；B ，蛋白相對水平的統(tǒng)計學(xué)分析；C，c-Fos mRNA水平的RT-PCR檢測；Con，Control，Mo，mock-treated；L，low group；M，medium dose；H，high dose；與對照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.1 Detection for the expression level of c-Fos in the cerebral cortex of offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy. A,western blot detection for the expression of c-Fos protein; B, statistical analysis for relative protein expression levels; C, RT-PCR detection for c-Fos mRNA; Con, Control; Mo, mock-treated; L, low group; M, medium dose; H, high dose; compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜P＜0.05; **,P＜0.01; n=5

2 妊娠期PM2.5暴露導(dǎo)致子代鼠大腦皮層p53表達增加

Western blot檢測顯示，與對照組相比，p53蛋白表達逐漸增多，并與PM2.5劑量成正比，且PM2.5中、高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3A、B）。熒光定量RT-PCR分析表明，與對照組相比，PM2.5中劑量組子代鼠大腦皮層p53 mRNA表達增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，PM2.5高劑量組p53 mRNA表達顯著增多（圖3C）。子代鼠大腦皮層額葉區(qū)免疫熒光染色和免疫熒光強度定量分析發(fā)現(xiàn)，p53陽性細胞主要分布在額葉區(qū)皮層的外顆粒層、錐體細胞層、內(nèi)顆粒層和節(jié)細胞層（Ⅱ-V層），其中PM2.5低、中劑量組p53在細胞質(zhì)中表達明顯，而p53在PM2.5高劑量組的細胞核、細胞質(zhì)中均有表達；p53免疫反應(yīng)性隨PM2.5濃度增加而增強，與對照組相比，PM2.5低、中、高劑量組p53免疫反應(yīng)性明顯增強，差異顯著（圖4A、B）。

討 論

大氣顆粒物尤其是平均空氣動力學(xué)直徑≤2.5μm的顆粒物（PM2.5）構(gòu)成了引起空氣污染的主要原因。重金屬，聚芳族烴和其他有毒類物質(zhì)易吸附到PM2.5表面，并且可隨PM2.5達到人體的一些特殊部位，導(dǎo)致功能的紊亂[7]。研究表明，空氣污染對孕婦和胎兒的發(fā)育有不利影響[8-9]。PM2.5顆粒物直徑很小，入肺后能透過母體氣血屏障和胎盤屏障，因此妊娠期暴露于空氣污染環(huán)境中，將對胎兒發(fā)育造成潛在的危害。在懷孕期間，胎兒神經(jīng)系統(tǒng)可能更容易受到環(huán)境毒物的負面影響，大腦的結(jié)構(gòu)和功能改變可能與神經(jīng)發(fā)育的結(jié)局有關(guān)，例如導(dǎo)致后代認知-運動發(fā)育水平降低和行為問題風(fēng)險增加，還包括發(fā)育遲緩等負面影響[10-11]。

圖2 高劑量PM2.5暴露后免疫熒光檢測顯示子代鼠大腦皮層額葉區(qū)c-Fos表達增強。A，c-Fos免疫熒光染色， Hoechst 復(fù)染細胞核；比例尺，20μm；B，c-Fos免疫熒光強度統(tǒng)計學(xué)分析；與對照組相比：*， 0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.2 Detection for c-Fos by immuno fluorescence in the frontal cortex of the offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy.A, immuno fluorescence staining of c-Fos , Hoechst counterstaining of nuclei; scale bar, 20μm; B, statistical analysis of c-Fos immuno fluorescence intensity; compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜ P＜0.05; **, P＜0.01; n=5

圖3 高劑量PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層p53表達增強。 A，p53蛋白水平的Western blot檢測；B，蛋白相對水平的統(tǒng)計學(xué)分析；C，p53的mRNA水平RT-PCR檢測；Con，Control；Mo，mock-treated；L，low group；M，medium dose；H，high dose；與對照組比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.3 Detection for the expression of p53 in the cerebral cortex of the offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy. A, detection for p53 protein by western blot; B, statistical analysis for relative protein expression levels; C, detection for p53 mRNA levels by RT-PCR ; Con,Control; Mo, mock-treated; L, low group; M, medium dose; H, high dose; compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜ P＜0.05; **, P＜0.01; n=5

妊娠是一個相當(dāng)復(fù)雜的生理過程，環(huán)境刺激對母體功能的潛在影響與胎兒發(fā)育有直接關(guān)系[12]。課題組前期已觀察到妊娠期PM2.5暴露可導(dǎo)致子代鼠腦損傷，并通過Caspase-3檢測初步推測妊娠期PM2.5暴露可引起子代鼠腦組織神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡。p53和c-Fos是應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激、炎癥和細胞凋亡有關(guān)的分子標(biāo)志物[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，妊娠期PM2.5暴露誘導(dǎo)子代鼠腦組織中p53、c-Fos基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均增加。p53是細胞正常功能所必需的重要調(diào)節(jié)因子，參與細胞存活和死亡相關(guān)的許多過程。近年來，大量的證據(jù)表明，p53可從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體并激活線粒體相關(guān)的凋亡途徑。p53升高可以引發(fā)細胞凋亡，從而消除DNA已被破壞無法修復(fù)的細胞，以防止其惡性轉(zhuǎn)化。盡管DNA損傷可能是導(dǎo)致p53積聚的主要信號，但在去核細胞中可能會發(fā)生一些早期的信號傳導(dǎo)，快速激活的膜相關(guān)蛋白激酶和信號分子參與了這些早期步驟，并激活A(yù)P-1和NF-κB。原癌基因c-Fos是一種即刻早期基因，與多種有絲分裂素誘導(dǎo)的細胞增殖和分化密切相關(guān)[14]。此外，c-Fos蛋白與抗增殖條件誘導(dǎo)的凋亡細胞死亡有關(guān)。c-Fos核蛋白與Jun家族蛋白二聚化形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1復(fù)合物，其參與不同的細胞過程，包括細胞增殖、分化和凋亡[15]。c-Fos作為p53靶基因，其活化可能有助于p53的下游作用，這種作用是通過c-Fos基因的第一個內(nèi)含子內(nèi)的獨特元件介導(dǎo)的，該基因與p53特異性結(jié)合。本實驗進一步用免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，c-Fos、p53蛋白在大腦皮層額葉區(qū)的錐體細胞層、內(nèi)顆粒層和節(jié)細胞層（Ⅲ-V層）中表達增多，并且PM2.5模型組c-Fos幾乎定位在細胞質(zhì)。在細胞正常增長的情況下c-Fos可在細胞核和細胞質(zhì)同時表達[16]，妊娠期PM2.5暴露可誘導(dǎo)子代鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-Fos的表達。細胞受刺激后，細胞核內(nèi)的c-Fos基因被激活，轉(zhuǎn)錄形成mRNA，后者進入胞漿，翻譯合成核磷蛋白，即c-Fos蛋白。當(dāng)PM2.5炎性刺激使細胞凋亡程序啟動，p53和c-Fos表達增多，證明了妊娠期PM2.5暴露對子代鼠大腦皮層的影響。

綜上，我們推測妊娠期PM2.5暴露可導(dǎo)致子代鼠大腦皮層凋亡相關(guān)基因c-Fos、p53激活，這可能導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡，是PM2.5致子代大腦皮層損傷的分子機制之一。妊娠期PM2.5暴露對子代鼠的生長發(fā)育中大腦皮層會產(chǎn)生不良的影響，妊娠期PM2.5暴露對新生兒的影響應(yīng)引起社會高度關(guān)注。

圖4 PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層額葉區(qū)免疫熒光檢測顯示p53表達增強。A，p53免疫熒光染色， Hoechst 復(fù)染細胞核；比例尺， 20μm；B，p53免疫熒光強度統(tǒng)計學(xué)分析；與對照組相比：*， 0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=5Fig.4 Detection for p53 by immuno fluorescence in the frontal cortex of the offspring mice born of maternal mice exposed to PM2.5 during pregnancy.A, immuno fluorescence staining of p53, Hoechst counterstaining of nuclei; scale bar, 20μm; B, statistical analysis of p53 immuno fluorescence intensity;compared with the mock-treated group∶ *, 0.01＜ P＜0.05; **, P＜0.01; n=5