李衛(wèi)峰 楊秋霞 林澤鵬 王李平 郭鵬然

(廣東省測試分析研究所，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東省原位電離質譜分析工程技術研究中心，廣州 510070)

1 引 言

食用油是食品中脂肪的重要來源，全球每年消耗的食用油超過1.7億噸[1]，但攝入不當會引發(fā)諸多疾病，如肥胖癥、心血管疾病[2]、肝功能異常[3]等。食用油中主要成分是甘油三酯(TAG)，因甘油鏈上脂肪酸的碳數(shù)或飽和度不同而種類繁多。不同種類的食用油因含有的TAG種類不同而使其營養(yǎng)價值和功效有著很大的差異。此外，由于不同種類食用油相似度高，難以區(qū)別，食用油摻假問題日趨嚴重。因此，發(fā)展一種食用油中TAG的快速、直接的分析方法在食品安全領域具有重要價值。

目前，食用油的分析方法種類很多，包括色譜法[4,5]、核磁共振波譜法[6]、紅外光譜法[7]和基于質譜的分析方法[8]等。質譜由于具有檢測速度快、靈敏度高、優(yōu)異的檢出限等優(yōu)點而應用更為廣泛?；谫|譜建立的方法主要包括氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)[9,10]、液相色譜質譜聯(lián)用法(LC-MS)[11～13]和直接進樣質譜法。與色譜-質譜聯(lián)用方法相比，直接進樣質譜技術避免了色譜分離或衍生化的過程，具有樣品分析速度快、通量高、易操作等特點，是當前分析技術的熱點[14]。目前，用于食用油中TAG的直接進樣質譜離子源技術主要包括電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學電離源(APCI)、基質輔助激光解吸電離源(MALDI)等[14～16]。其中，ESI源主要適用于測定其中的脂肪酸、酚類等極性成分，且有時需鹽離子輔助才能獲得好的信噪比譜圖。而APCI源則用于測定中等極性或弱極性的組分，由于APCI源獲得的譜圖有3種特征的碎片離子，根據(jù)碎片離子的信息可推斷TAGs的組成及脂肪酸的酰基位置[17]。與ESI源和APCI源溶液進樣方式相比，MALDI源可直接作用于固體樣品，具有樣品制備方便、易操作、耐鹽度好的優(yōu)點，已被廣泛應用于油品的快速定性分析[18～20]。

本研究利用MALDI-FTICR-MS對食用油中的TAG進行了定性分析，建立了一種簡便、快速分析食用油中TAG的方法。根據(jù)一級質譜圖可初步區(qū)別不同種類的食用油，利用主成分分析軟件(PCA)可高效區(qū)分34種不同種類的食用油，并應用于橄欖油中摻雜菜籽油的識別分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SolariX XR 7.0T傅里葉變換離子回旋共振質譜儀(FTICR-MS，美國Bruker公司)，配有電噴霧電離源(ESI)、大氣壓化學電離源(APCI)和基質輔助激光解吸電離源(MALDI)等。其中MALDI源的Smartbeam II固態(tài)激光器的能量在0～300 μJ可調，頻率在0～1 kHz可調，激光波長為355 nm，激光光斑可調。WH-3微型漩渦混合儀(上海瀘西分析儀器有限公司)。

丙酮、二氯甲烷(分析純，廣州化學試劑廠)；三氟乙酸鈉(NaTFA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB, 純度≥99%)，購自美國Sigma-Aldrich公司；除豬油自制外，不同品牌的花生油、菜籽油、橄欖油、玉米油、大豆油、向日葵油等共34種食用油均購自本地超市。

2.2 實驗方法

2.2.1樣品制備(1)食用油樣品制備 準確移取4 μL樣品，分別溶于1 mL二氯甲烷，混勻待測。(2)摻雜食用油制備 將菜籽油與橄欖油按不同體積比(0%、5%、10%、20%、40%、60%)配制成系列混合食用油樣品，然后準確移取4 μL樣品分別溶于1 mL二氯甲烷后，混勻待測。(3) DHB基質制備 將1 mg DHB溶于500 μL丙酮溶液。(4) MALDI點樣 先移取1 μL基質溶液于MALDI樣品靶上，待基質自然晾干形成結晶層，再移取1 μL制備好的食用油樣品點于結晶層上，待進樣分析。

2.2.2質譜條件采用MALDI源正離子模式，激光能量為15%，光斑選擇為Medium模式，頻率為100 Hz，輻照次數(shù)為100 Shots，作用路徑為Random。質量采集范圍m/z50～1500，采樣大小為1 M，累加次數(shù)為8，和諧阱累積時間設為2 ms。進行二次質譜測定時，隔離窗口(Isolation window)設為10，碰撞能量為25 eV。數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析采用儀器配有的DataAnalysis 4.4和ProfileAnalysis 2.2軟件進行處理。

3 結果與討論

3.1 質譜條件的考察

對于MALDI源，基質結晶質量決定了質譜信號的穩(wěn)定性。據(jù)報道，對于分析食用油中的TAG而言，當采用DHB的丙酮溶液作為基質時，先點基質再點樣品的分步點樣方式可以獲得更為穩(wěn)定的質譜信號和強的信噪比[21]。因此，在實驗過程中，采用分步點樣方式進行制樣。以往的文獻報道中多采用氯仿或者正己烷等毒性較低的溶劑來溶解食用油，本實驗采用毒性更低的二氯甲烷作為溶劑進行樣品制備。激光的相關參數(shù)(如激光頻率、激光能量、激光光斑等)是影響質譜圖質量的重要因素。在一定的激光光斑條件下，增加激光能量和頻率會增強離子流，但是如果離子流太強，過剩的離子會在質量分析器中發(fā)生嚴重的電荷排斥現(xiàn)象，影響質量軸的精度。為保證質量軸精度，選擇激光能量為15%，激光頻率為100 Hz，輻照次數(shù)為100 Shots，光斑為Medium模式進行后續(xù)實驗。以4種不同的橄欖油作為代表進行了重復性驗證。經(jīng)過重復測定質譜圖中m/z881.76081與m/z907.77650的峰強度比后，對4種橄欖油均可以獲得良好的重復性，相對標準偏差(RSD)均低于9%，表明本方法的可行性良好。

3.2 食用油樣品分析

3.2.1不同種類食用油的分析為確保分析結果的準確性，每次實驗之前均在ESI源正模式條件下用三氟乙酸鈉校正液對質量軸校正。圖1A為玉米油樣品MALDI-MS的歸一化質譜圖，其中青色區(qū)域代表TAG的鈉離子復合峰[TAG+Na]+，粉色區(qū)域代表甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)離子峰或TAG的碎片。由圖1A可知，DAG與TAG的比例與食用油本身含有的比例相差較大。這是因為大部分DAG由TAG碎裂形成，所以在圖1A中將甘油二酯的區(qū)域標記為DAG or fragments。圖1B是甘油二酯的局部放大圖，二酯類成分主要由含18個碳的脂肪酸，如亞麻酸(Ln，C18H30O2)、亞油酸(L，C18H32O2)和油酸(O，C18H34O2)兩兩組合而成。TAG的局部放大圖如圖1C所示， TAG共分兩類，一類只含單個的棕櫚酸(P，C16H32O2)，另一類不含棕櫚酸。通常，根據(jù)以上兩類TAG的含量或特征峰可初步識別不同類型的食用油。

圖1 玉米油的MALDI-FTICR-MS質譜圖，質荷比范圍分別為(A) m/z 400～1000，(B) m/z 596～605，(C) m/z 870～915。P: 棕櫚酸; Ln: 亞麻酸; L: 亞油酸; O: 油酸; S: 硬脂酸。Fig.1 Typical matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectra (MALDI-FTICR-MS) of corn oil at various mass-to-charge ranges: (A) m/z 400-1000, (B) m/z 596-605 and (C) m/z 870-915. P: palmitic acid; Ln: linolenic acid; L: linoleic acid; O:oleic acid; S: stearic acid.

圖2 不同種類食用油中的TAGs的MALDI-FTICR-MS質譜圖: (A)大豆油, (B)向日葵油, (C)花生油, (D)玉米油, (E)菜籽油, (F)橄欖油和(G)動物油Fig.2 MALDI-FTICR-MS spectra of triacylglycerols (TAGs) from different edible oils: (A) soybean oil, (B) sunflower oil, (C) peanut oil, (D) corn oil, (E) canola oil, (F) olive oil, (G) animal oil.

圖2為7種不同類型食用油中的TAG的質譜圖, 可見利用一級質譜圖很容易區(qū)分植物油與動物油，這主要是因為與植物油相比，動物油中含有的棕櫚酸比例增加，其低質荷比的TAG所占的比例升高[16]。根據(jù)此特點，可以快速區(qū)分植物油與動物油。對于6種植物油來說，雖然成分類似，但根據(jù)TAG的譜圖也可進行初步的識別。由圖2可知，橄欖油主要由單一的不飽和脂肪酸油酸(O)構成，譜圖簡單，根據(jù)特征峰m/z881.76081(POO)與m/z907.77650(OOO)的比例即可與其它食用油進行區(qū)分。與其它植物油相比，菜籽油低質荷比的TAG(如m/z881.76150)所占的比例最小。與玉米油比，向日葵油的特征峰m/z877.73150(PLL)與m/z903.74614(LLO)峰值比例降低?；ㄉ椭杏退岢煞衷黾?，所以TAG中m/z879.74620(PLO)與m/z905.76158(LOO)變?yōu)樘卣鞣?。由于亞油酸含量增加，大豆油的TAG以m/z877.73201(PLL)與m/z901.73202(LLL)為最高含量，以上獲得的譜圖結果與之前報道的結果基本類似[1]。因此，根據(jù)一級質譜可對不同種類的食用油進行初步的定性分析。

圖3 不同種類食用油中不同類型TAG的碎片質譜圖: (A)玉米油m/z 877.72547二級譜圖，(B)玉米油m/z 903.74150二級譜圖，(C) 橄欖油m/z 881.75700二級譜圖，D)橄欖油m/z 907.77253。Fig.3 Various TAG fragments mass spectra from different types of edible oils: (A) m/z 877.72547 in corn oil, (B) m/z 903.74150 in corn oil, (C) m/z 881.75700 in olive oil, (D) m/z 907.77253 in olive oil.

3.2.2不同種類食用油的二級譜圖為了進一步對食用油中TAG的定性分析進行探究，以玉米油和橄欖油為例對部分TAG進行了二級譜圖比較。如圖3所示，當選取玉米油中母離子m/z877.72547進行二級質譜實驗時，碎片離子分別為m/z597.48529和621.48509。經(jīng)過計算推導得知，以上獲得的碎片峰是由TAG去掉一個亞油酸或棕櫚酸形成，即[PL+Na]+和[LL+Na]+。當選取母離子(m/z903.74150)進行二級實驗時，碎片峰來源主要是通過脫掉一個亞油酸或亞油酸鈉后形成，分別為[LO+Na]+和[LO+H]+，主要以Na+復合峰為主[22]。此外，對于橄欖油，m/z881.75700的碎片是通過脫掉一個油酸分子(O)或者棕櫚酸分子(P)形成，即[PO+Na]+和[OO+Na]+。m/z907.77253的碎片則是脫掉一個油酸或油酸鈉后形成，具體信息見圖3C和3D。橄欖油和玉米油的二級譜圖說明，二級譜圖為定性分析提供了更為豐富的信息?？傊?，低質荷比的TAG的碎片峰斷鍵的方式有兩種，而高質荷比的TAG斷鍵方式只有一種，根據(jù)二級圖譜碎片碎裂的信息，可以初步獲得所測樣品中TAG的脂肪酸組成及各個脂肪酸飽和度等定性分析的信息[21,23,24]。

3.2.3主成分分析通過一級質譜圖中TAG的分布可初步區(qū)別不同種類的食用油，但在實際分析中，食用油種類繁多，樣本復雜，應利用統(tǒng)計學進行快速篩選分類。本研究采用主成分分析方法對34種食用油進行分類。在m/z860-920質荷比范圍內經(jīng)過歸一化處理后進行數(shù)據(jù)處理并分析，結果如圖4和圖5所示(PCA圖中每個點代表一個樣品)。由圖4可知，在置信度為95%的條件下，同一類樣品得到了很好的歸類，且7類食用油得到很好分離，其中PC1和PC2的差異值分別為66.7%和80.6%(圖5)，表明MALDI-FTICR-MS技術能夠有效區(qū)分不同種類食用油，為食用油的篩查和鑒定提供了基礎。

圖4 34種食用油的主成分分析的得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.4 Principal component analysis (PCA) results of 34 kinds of edible oils: (A) scores plot and (B) loadings plot

圖5 不同主成分的差異值Fig.5 Variance value of different principal components

3.3 橄欖油中菜籽油摻雜量與峰強度比的關系

由于含有豐富的不飽和脂肪酸及其它多種易被人體消化吸收，且具有一定美容功效的緣由，橄欖油被人們譽為“液體黃金”，其價格長期以來一直居高不下。一些不法分子常會在橄欖油中摻入其它低價格的食用油，由于摻入的食用油的脂肪酸成分與橄欖油高度相似，常規(guī)手段很難進行快速識別。為驗證MALDI-FTICR-MS方法對食用油快速準確的識別能力，本研究在橄欖油中摻入了不同比例的菜籽油進行分析，歸一化的質譜結果如圖6所示。以往的文獻報道中，根據(jù)特征峰如低質荷比的TAG(如m/z881.76)和高質荷比的TAG(m/z907.78)的比例變化即可識別橄欖油中是否摻雜菜籽油[1]。本研究直接利用高質荷比的TAG的變化進行識別區(qū)分。由圖6可知，隨著菜籽油摻入比例的增加，相比于m/z907.77586，m/z903.74481的強度逐漸增加，因此通過m/z903.74481和m/z907.77586的相對強度也可對食用油摻雜進行識別。每組數(shù)據(jù)平行測定5次，以I903.74481/I907.77586或I901.72957/I905.76004強度的平均值與摻入的菜籽油比例作圖，在0%～60%含量范圍內可以獲得良好的線性關系(圖7)。即使摻雜5%的菜籽油也可被直接快速識別。這些結果表明，當采用高質荷比的TAG的變化趨勢作為研究對象時，MALDI-FTICR-MS同樣具有食用油摻雜的快速識別能力。

圖6 m/z 903.74481和m/z 907.77586譜峰強度隨著橄欖油中菜籽油含量的變化趨勢Fig.6 Intensity of m/z 903.74481 and m/z 907.77586 as a function of canola percentage in olive

圖7 (A) I901.72957/I905.76004和(B) I903.74481/I907.77586強度比與菜籽油中摻雜橄欖油的含量線性圖Fig.7 Plot of intensity ratio of I901.72957/I905.76004 (A) and I903.74481/I907.77586 (B) against percentage of canola in olive oil

4 結 論

本研究建立了一種用于食用油中TAG的MALDI-FTICR-MS直接快速分析方法。結合一級和二級質譜圖可以快速區(qū)分不同種類的食用油，并可提供脂肪酸組成及各個脂肪酸的飽和度信息。利用主成分分析法，可以明顯地將34種食用油分為7類，通過高質荷比的TAG的變化趨勢可直接識別摻雜5%菜籽油的橄欖油。本方法簡便、快速、可靠， 有望成為快速篩查食用油的有效分析方法。

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