王馥香

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 南陽(yáng)473000)

布魯桿菌?。˙rucellosis，簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪敆U菌侵入機(jī)體引起的慢性變態(tài)反應(yīng)性傳染病，可感染人類、多種野生動(dòng)物和多種家畜。布魯桿菌病在世界上170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)之間流行，共約500～600萬(wàn)布魯桿菌病患者，每年約50萬(wàn)新發(fā)患者，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的生命健康，大大影響了畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]，年經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。目前只有澳大利亞和英國(guó)通過(guò)嚴(yán)格的防疫措施徹底消滅了布魯桿菌病。布魯桿菌病仍是全球特別是發(fā)展中國(guó)家面臨的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，我國(guó)將人間布魯桿菌病法定為乙類傳染病?；疾〉呢i、牛、羊?yàn)橹饕膫魅驹?，牧民和獸醫(yī)是主要的感染者，病原菌通過(guò)呼吸道、消化道、損傷的皮膚或黏膜等途徑傳播。布病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸復(fù)雜，與多種疾病類似，臨床上難以鑒別診斷，易被誤診[4-6]。布病的預(yù)防和控制的關(guān)鍵是對(duì)致病微生物的快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和診斷。目前用于布病的主要診斷技術(shù)有：細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)（虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、平板凝集試驗(yàn)（RPST）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、膠體金免疫層析法(GICA)、抗球蛋白試驗(yàn)(Coomb's試驗(yàn)或 AGT)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(iELISA)、核酸檢測(cè)（PCR）等[7-9]。目前，布魯桿菌病的診斷方法種類越來(lái)越多，但是至今還沒(méi)有一種具有特異性、敏感性、易行、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)方法。為了能夠更好地對(duì)布病患者進(jìn)行診斷，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)，本文對(duì)在本院2014年1月至2016年4月期間門(mén)診和住院治療的布病患者接受 RBPT、SAT、iELISA以及細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 一般資料 142例2014年1月至2016年4月在我院門(mén)診和住院的布病患者，以及50例健康體檢者作為對(duì)照。其中男108例，年齡28～62歲，平均年齡為 38．4 歲；女 34 例，年齡 30～58 歲，平均年齡為 37．5 歲；對(duì)照組：男 23 例，年齡 24～65 歲，平均年齡為 36．2 歲；女 27 例，年齡 25～64 歲，平均年齡為36．8歲。居住地分布在全省，主要來(lái)源于畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的農(nóng)村地區(qū)，各地區(qū)之間無(wú)顯著差異。臨床診斷以衛(wèi)生部地方病防治司頒布的布病診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。參考文獻(xiàn)[4]臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、高燒，伴有關(guān)節(jié)疼痛和肝脾腫大。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 使用法國(guó)梅里埃公司的全自動(dòng)血培養(yǎng)儀Bacd/Alert 60進(jìn)行門(mén)診和住院疑似布病患者血液樣本分離培養(yǎng)。具體操作如下：取來(lái)自于臨床門(mén)診和住院的疑似布病患者的靜脈血8～10ml，接種至血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。若有陽(yáng)性報(bào)警，再轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板培養(yǎng)。最后再使用法國(guó)梅里埃公司的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀VITEK-2進(jìn)行菌株鑒定。

1．2．2 虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)采取臨床上門(mén)診和住院的疑似布病患者以及健康體檢者的靜脈血1～2ml，待血液凝固后，室溫 2500r/min 離心 15min，獲取血清。取干凈的玻片或者有凹型孔的玻片，向玻片上分別加30μl待檢血清和30μl虎紅平板凝集抗原，充分混勻抗原和血清，5min內(nèi)判定結(jié)果。出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒則判斷為陽(yáng)性，記為（+）；未見(jiàn)凝集顆粒則判定為陰性（-）。每次試驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1．2．3 試管凝集試驗(yàn)（SAT） 取5支小試管，向第1管加入2．3ml生理鹽水，向第2到5管各加入生理鹽水 0．5ml，將 0．2ml被檢血清加入第 1 管中，充分混勻后取0．5ml至第2管并棄掉1．5ml， 充分混勻后，從第2管中取0．5ml至第3管，以此類推至第5管，第5管充分混勻后棄掉0．5ml。每管含稀釋的血清均為0．5ml。然后再向第1到5管中各加入10倍稀釋的試管凝集抗原 （布魯桿菌菌體抗原）0．5ml，最后每管反應(yīng)體積為1ml；待檢血清稀釋度從第 1～5 管分別為：1：25、1：50、1：100、1：200 和1：400。充分振蕩混勻后，將試管置于37℃溫箱孵育20～22h，然后與標(biāo)準(zhǔn)的濁度管進(jìn)行對(duì)比判定結(jié)果。待檢血清效價(jià)在1∶100(++)及以上者為陽(yáng)性，1：50（+）為可疑，以下則為陰性。

1．2．4 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (iELISA)人布魯菌病IgG(Brucellosis IgG)間接ELISA檢測(cè)試劑盒由上海美旋生物科技有限公司銷售的德國(guó)IBL產(chǎn)品，編號(hào)：RE56821。操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性：＞12U/ml，可疑 8～12U/ml，陰性＜8U/ml。標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控：A為1U/ml，臨界質(zhì)控：B 為 10U/ml，弱陽(yáng)性質(zhì)控：C 為 50U/ml，陽(yáng)性質(zhì)控：D 為 200U/ml。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用 SPSS 18．0 將 RBPT、SAT、iELISA、血培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0．05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 142例門(mén)診和住院的疑似布病患者血培養(yǎng)結(jié)果均為陽(yáng)性，健康對(duì)照組血培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。血培養(yǎng)4～5d后開(kāi)始陽(yáng)性報(bào)警，接種至血瓊脂平板上生長(zhǎng)緩慢，2d后開(kāi)始出現(xiàn)針尖樣大小的菌落。革蘭染色為陰性短小球桿菌，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀VITEK-2鑒定后為馬爾他布魯菌（Br.melitensis）。

2．2 血清學(xué)檢測(cè) 142例門(mén)診和住院的疑似布病患者血清虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為：139例陽(yáng)性，3例陰性，健康對(duì)照組血培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，和血培養(yǎng)結(jié)果比較無(wú)顯著差異（P＞0．05）。經(jīng)試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為：135例陽(yáng)性，7例陰性，健康對(duì)照組均為陰性，與血培養(yǎng)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。人布魯氏菌病 IgG 檢測(cè)結(jié)果為 137例陽(yáng)性，5例陰性，健康對(duì)照組均為陰性，與血培養(yǎng)結(jié)果比較，差異不顯著（P＞0．05）（表 1）；對(duì) 3 種布病常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

3 討論

布魯桿菌病的診斷方法較多，包括病原學(xué)、血清學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)。其中布魯桿菌的分離鑒定即病原學(xué)檢測(cè)是布病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低、培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、方法復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)室操作具有潛在的危險(xiǎn)性等缺點(diǎn)[10-12]；因此，臨床上布病的診斷以血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)為主。布魯桿菌侵入機(jī)體后會(huì)不斷地刺激機(jī)體產(chǎn)生凝集性抗體、補(bǔ)體結(jié)合抗體、調(diào)理素和沉淀抗體等，檢測(cè)血清抗體對(duì)診斷病情具有重要的意義，但是該檢測(cè)方法不能區(qū)別自然感染抗體、免疫抗體以及一些非布魯桿菌的感染 （如耶爾辛氏菌0：9產(chǎn)生的抗體）。當(dāng)前已有多種布病的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，且各具特色，但是都存在一定的局限性，至今仍然缺乏一種具備特異性、敏感性、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單的血清學(xué)檢測(cè)方法[13，14]。目前，國(guó)內(nèi)使用較多的布病檢測(cè)方法有RBPT、SAT、iELISA以及全血培養(yǎng)等[15，16]。其中RBPT檢測(cè)特異性低、結(jié)果易受測(cè)試溫度和凝集時(shí)間短和人為主觀判斷等因素影響，不易做出準(zhǔn)確的診斷，主要用于初篩。SAT是布病診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法，主要用于定性。RBPT和SAT檢測(cè)的抗體主要是IgM，而當(dāng)人體感染布魯桿菌后產(chǎn)生最多并且持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的是IgG抗體，因此這兩種檢測(cè)方法容易受到體內(nèi)其他IgM抗體的影響。本研究對(duì)142例在2014年1月至2016年4月來(lái)我院門(mén)診和住院的疑似布病患者以及健康對(duì)照組的血清樣本進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)和常規(guī)血清學(xué)的檢測(cè)。患者血培養(yǎng)結(jié)果為全陽(yáng)性，健康對(duì)照組為全陰性；使用RBPT檢測(cè)出陽(yáng)性139例、陰性3例，健康對(duì)照組為全陰性，兩種檢測(cè)方法具有較高的符合率；該結(jié)果可能是由于RBPT可以同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM抗體，使其具有較高的陽(yáng)性檢出率。而SAT檢測(cè)結(jié)果具有較高的假陰性率：135例陽(yáng)性，7例陰性，其原因可能是與患者的疾病進(jìn)程有關(guān)，疾病已過(guò)急性期，患者血清中的IgM已消失。本研究中使用的人布魯菌病IgG(Brucellosis IgG)間接ELISA檢測(cè)方法正好彌補(bǔ)了該缺點(diǎn)，檢出137例陽(yáng)性和5例陰性；較SAT具有較高的陽(yáng)性檢出率，與血培養(yǎng)結(jié)果具有較高的符合率。但是，由于人感染布魯桿菌后首先體內(nèi)產(chǎn)生的是IgM抗體，使用該檢測(cè)方法則容易漏檢布病的感染初期。本研究中，RBPT、SAT和iELISA檢測(cè)結(jié)果與血培養(yǎng)檢測(cè)均具有較高的符合率，分別與血培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較差異不顯著（P＞0．05）。

表1 三種布魯桿菌病血清學(xué)檢測(cè)方法結(jié)果比較

因此，綜合以上檢測(cè)結(jié)果，本研究中布病的四種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。臨床上只有將多種檢測(cè)方法相互結(jié)合和補(bǔ)充，使用不同檢測(cè)方法并將其結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，再結(jié)合流行病學(xué)和臨床癥狀做出正確的診斷，從而對(duì)布病患者進(jìn)行正確的用藥和治療。同時(shí)，建議臨床上進(jìn)行大規(guī)模的檢查和篩選時(shí)，先使用具有特異性、價(jià)格低廉、敏感性較高、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，然后再使用兩種或多種不同的檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)核，然后再結(jié)合流行病學(xué)和臨床癥狀做出確診。

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