張麗琴，管海寧，肖作淼，劉聰，肖九長，鄒淑慧

(贛州市人民醫(yī)院檢驗科，江西 贛州 341000)

陰溝腸桿菌是一種常見的條件致病菌，可導致傷口、呼吸道、泌尿道的嚴重感染，且多為醫(yī)院內(nèi)感染[1]。隨著治療多重耐藥陰溝腸桿菌的碳青霉烯類抗生素在臨床的廣泛使用甚至濫用，導致碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的檢出逐年增多，給臨床的感控和治療帶來了重重困難。陰溝腸桿菌對碳青霉烯類耐藥主要是產(chǎn)生碳青霉烯酶[2]，但多種耐藥機制可協(xié)同作用，造成陰溝腸桿菌耐藥水平高及多重耐藥的現(xiàn)象[3，4]。本研究對收集的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌菌株采用改良Hodge試驗進行碳青霉烯酶表型確證，利用PCR擴增技術檢測目標菌株的碳青霉烯酶基因型和主動外排系統(tǒng)的AcrAB-TolC基因型，分析相關臨床感染資料，為臨床合理用藥及院感防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 菌株來源 2012年1月至2015年12月本院臨床標本中分離的經(jīng)Vitek 2 compact鑒定藥敏的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌76株，剔除同一患者的重復菌株。質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1．2 主要儀器及試劑 法國梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek 2 compact全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)及配套的GN、AST-GN16卡；PCR擴增儀為德國艾本德公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀為美國博樂公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為法國VILBER公司產(chǎn)品。細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科 技 有 限 公 司 ；Taq DNA Polymerase cat．No．：B500010 （內(nèi) 含：10×buffer、Mg2+、Taq DNA Polymerase）和dNTP購自上海生工生物工程有限公司。

1．3 方法

1．3．1 改良Hodge試驗 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會 (CLSI)M100-S24進行[5]，將大腸埃希菌ATCC 25922調制成0．5麥氏濁度后再用生理鹽水稀釋10倍涂布于MH平板，中間貼厄他培南（10μg)紙片，用接種環(huán)挑取受試菌自紙片外緣向平板邊緣劃線接種，35℃孵育過夜，厄他培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長者為待檢菌產(chǎn)碳青霉烯酶。

1．3．2 PCR檢測目標基因 陰溝腸桿菌DNA的提取嚴格按照試劑盒說明書進行。所有引物由上海生工生物工程公司合成，詳見表1。PCR反應體系為 20μl：10×buffer 2．0μl，Mg2+（25mM）1．2μl，dNTP（2．5mM）1．6μl，Taq DNA Polymerase（5U/μl）0．5μl，上、下游引物（10μM）各 1．0μl，DNA 模板 2．0μl，ddH2O 10．7μl。 反應條件：acrA 基因：95℃，5min→（95℃，30s+60℃ 30s+72℃，30s)×30 循 環(huán)→72℃，10min；acrB 基 因 ：95℃ ，5min→（95℃，30s+60℃ ，30s+72℃，30s)×30 循環(huán)→72℃，10min；tolC 基因：95℃，5min→（95℃，30s+60℃，30s+72℃，30s)×30 循環(huán)→72℃，10min。IMP和KPC基因引物和反應條件參照文獻進行[6，7]。反應結束后取5μl PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)含Goldview I型核酸染色劑的2%瓊脂糖凝膠電泳40min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。隨機選取部分PCR陽性產(chǎn)物送上海生工測序，在NCBI基因庫中比對證實。

表1 目標基因的引物序列和產(chǎn)物長度

2 結果

2．1 菌株來源和藥敏結果 76株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌分離自ICU16株（21．1%），神經(jīng)外科、燒傷科和急診科各8株（10．5%），脊柱科和泌尿外科各 6 株（7．9%），其它科室 24 株（31．6%）；標本來源為痰26株 （34．2%），傷口分泌物和尿各18株（23．7%），其它標本 14 株（18．4%）；藥敏結果顯示，未出現(xiàn)對替加環(huán)素耐藥菌株，僅阿米卡星的耐藥率低于30%，其余常用抗菌藥物均呈現(xiàn)高度耐藥現(xiàn)象，詳見表2。

2．2 改良Hodge試驗結果 76株目標菌株經(jīng)改良Hodge試驗檢測10株為陰性，66株碳青霉烯酶表型陽性，陽性率 86．8%。

2．3 目標菌株的基因檢測結果 76株目標菌株中，碳青霉烯酶IMP基因型的檢出率為63．2%，KPC型檢出率為7．9%；AcrAB-TolC外排泵acrA基因的檢出率為78．9%，acrB基因的檢出率為50．0%，tolC基因的檢出率為100%，電泳圖見圖1。

2．4 碳青霉烯耐藥陰溝腸桿菌臨床感染資料分析76例碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌感染病例中，新生兒2例，其余均為成人，且以＞60歲的老年人感染為主，占 60．5%（46/76）；52 例具有一項或多項的基礎疾?。ㄈ缏阅I功能不全、糖尿病、惡性腫瘤、心功能不全、肝硬化、慢性阻塞性肺氣腫、腦血管病變、免疫性疾病等），占 68．4%(52/76)；留置導尿管及氣管插管等侵襲性操作所占的比例也較高，分別占 76．3%(58/76)和 68．4%(52/76)；特別在抗菌藥物使用方面，76例感染者均在檢出耐藥菌之前使用過抗菌藥物，其中使用3種及3種以上抗菌藥物的有 48例，占 63．2%，見表 3。

表2 76株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌對常用抗菌藥物的藥敏結果(%)

圖1 五種基因的PCR擴增結果電泳圖

表3 76例患者抗菌藥物使用情況

3 討論

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，特別是針對重癥感染的碳青霉烯類藥物使用的增加，使得碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌有逐年上升傾向。本次研究的菌株主要分布在ICU、神經(jīng)外科、燒傷科和急診科，可能與這些科室的住院患者病情危重，且多經(jīng)歷過創(chuàng)傷性手術及術后均有侵襲性操作有關。另外，藥敏結果提示替加環(huán)素對碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的敏感性高，可作為治療該菌的首選藥物，且它的抗菌作用不受產(chǎn)酶影響[8]。

KPC和IMP型碳青霉烯酶分屬于Ambler分類中的A類和B類β-內(nèi)酰胺酶。CLSI推薦改良Hodge試驗作為篩選腸桿菌科細菌KPC型碳青霉烯酶的確證試驗，但龐峰等證實改良Hodge試驗檢測IMP型碳青霉烯酶同樣具有較高的靈敏度[9]。測序結果顯示76株目標菌株擴增出IMP和KPC型碳青霉烯酶的總比例達71．1%，說明江西贛州地區(qū)碳青霉烯酶的流行不在少數(shù)，且是以IMP型為主，與林伯熹等[10]報道一致。陰溝腸桿菌耐藥機制復雜，產(chǎn)碳青霉烯酶是陰溝腸桿菌對碳青酶類抗菌藥物耐藥的主要機制，但在細菌多重耐藥性產(chǎn)生過程中主動外排系統(tǒng)也發(fā)揮了重要作用[11]。AcrAB-TolC外排系統(tǒng)隸屬于主動外排系統(tǒng)的耐藥結節(jié)分化超家族，由acrA，acrB以及tolC三部分組成，它廣泛存在于大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等腸桿菌科細菌中，可主動將進入菌體內(nèi)的抗生素泵出，使藥物濃度下降難以發(fā)揮抗菌作用而出現(xiàn)耐藥[12，13]。本實驗中acrB基因的檢出率稍低，但tolC基因的檢出率高達100%，說明AcrAB-TolC外排系統(tǒng)基因在陰溝腸桿菌中普遍存在，據(jù)胡小行等報道AcrAB-TolC外排系統(tǒng)對耐藥陰溝腸桿菌株的影響大于敏感株[14]，它的高表達可表現(xiàn)對β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、甲氧芐啶等多種常用抗菌藥物耐藥。當然，除上述兩種耐藥機制以外，也可能存在其它耐藥機制（ESBLs的高表達、產(chǎn)AmpC酶合并孔蛋白的缺失等）的協(xié)同作用，造成了陰溝腸桿菌高水平耐藥現(xiàn)象。

臨床資料分析顯示具有基礎疾病的老年患者、留置導尿管、氣管插管的感染病例占60%以上，這些都是碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌感染的高風險因素，特別是長期、大量使用抗菌藥物是最獨立、最重要的高危因素。除碳青霉烯類外，β-內(nèi)酰胺/酶抑制劑類、氟喹諾酮類、頭孢菌素類作為臨床醫(yī)生常選用的廣譜抗菌藥物同樣與碳青霉烯酶的產(chǎn)生具有相關性[15，16]。如何主動篩查產(chǎn)酶菌株，合理有效的選用抗菌藥物，延緩耐藥菌的出現(xiàn)，做好耐藥菌的控制，所涉及的每個環(huán)節(jié)層層相扣，息息相關。微生物人員應主動發(fā)現(xiàn)及時上報產(chǎn)酶株；臨床醫(yī)務人員應盡量減少碳青霉烯類抗生素的暴露和侵入性的操作，加強抗菌藥物的優(yōu)化管理，做好隔離防護，控制交叉?zhèn)鞑?；感控人員實行全院立體式監(jiān)管，深入臨床進行耐藥菌的專題培訓，提高醫(yī)務人員的認識性和積極性，對耐藥菌的控制將取得良好的效果。

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