黃雪瓊，吳普昭，黃誠記

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 511400)

丙型肝炎病毒是一種經(jīng)血液傳播引起慢性肝臟疾病的RNA病毒，其核酸是單股、線性、正鏈RNA。由于HCV-RNA復(fù)制所依賴的聚合酶缺乏校正功能，HCV基因組呈現(xiàn)高度特異性[1]。根據(jù)不同區(qū)域的基因序列變異情況，HCV分為6個(gè)基因型和80多種基因亞型。不同HCV基因型感染者的臨床表現(xiàn)、肝病嚴(yán)重程度及慢性化病程進(jìn)展均有差異，抗病毒治療的效果也不同[2]，近年來的研究表明，HCV的基因型與丙型肝炎的治療方案及治療周期關(guān)系密切[3，4]。本文通過統(tǒng)計(jì)分析番禺地區(qū)丙型肝炎患者病毒基因型及基因型與病毒載量的相關(guān)性，以了解本地區(qū)丙型肝炎患者的病毒基因型構(gòu)成狀況及為個(gè)體化抗病毒治療方案提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 2016年在廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院門診和住院所有HCV-RNA陽性的丙型肝炎患者，共收集125例病例。

1．2 標(biāo)本采集 空腹靜脈采血3ml，3000r/min離心5min；吸取上層血清立即檢測(cè)或置于1．5ml經(jīng)高溫高壓滅菌處理的EP管內(nèi)，-70℃保存待測(cè)。

1．3 儀器和試劑 ABI 7500 Real Time PCR system實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀，YN-H16分子雜交儀、GELDOCXR+凝膠成像分析儀。丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒和丙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑盒，均購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1．4 血清HCV-RNA定量檢測(cè) 嚴(yán)格按照丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒操作說明書和實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行HCV-RNA定量檢測(cè)。

1．5 HCV 基因分型檢測(cè)

1．5．1 HCV-RNA提取 嚴(yán)格按照丙型肝炎病毒基因分型核酸提取試劑盒操作說明書提取血清標(biāo)本HCV-RNA，并對(duì)已提取的病毒核酸溶液立即進(jìn)行擴(kuò)增。

1．5．2 RT-PCR擴(kuò)增 取PCR反應(yīng)管，加入反應(yīng)試劑和30ul已提取的病毒核酸溶液，滴加礦物油后瞬時(shí)離心封閉。按反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃逆轉(zhuǎn)錄25min，95℃預(yù)變性 15min，94℃ 30s→ 55℃ 40s→72℃45s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后72℃延伸7min。

1．5．3 雜交反應(yīng) 將預(yù)先經(jīng)過 98℃變性 10min、隨后立即冰浴冷卻的PCR產(chǎn)物加入已放有雜交膜條的雜交管中，低速轉(zhuǎn)動(dòng)（100～150r/min），50℃雜交60min。雜交完成后進(jìn)行洗膜、顯色，用凝膠成像分析儀掃描記錄結(jié)果。結(jié)果如圖1。

圖1 HCV基因分型結(jié)果示意圖。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以表示，1b型與非1b型病人血清HCV-RNA載量比較采用t檢驗(yàn)，1b型與非1b型低病毒載量水平與中高病毒載量水平的人數(shù)比例比較采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0．05，以 P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 番禺區(qū)丙型肝炎患者丙肝病毒基因型構(gòu)成狀況 125例HCV-RNA陽性樣本中，檢測(cè)出1b、2a、3a、3b、6a，5種基因型。其中1b型為比例最大的基因型，占 48．0%（60/125）；其次為 6a 型，占 27．2%（34/125）； 其余 2a 型占 8．0%（10/125），3a 型 占10．4%（13/125），3b 型占 6．4%（8/125）；詳見表 1。

表1 番禺區(qū)丙型肝炎患者HCV基因型構(gòu)成狀況

2．2 丙肝病毒基因型與病毒載量的相關(guān)性

2．2．1 由于 1b 型占 48．0%，為本地區(qū)主要基因型，因此采取對(duì)1b型組和非lb型組之間HCV-RNA載量進(jìn)行比較，結(jié)果 t=2．417，P＜0．05。 兩者病毒載量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1b型患者HCV-RNA載量高于非1b型患者，見表2。

表2 1b型與非1b型血清病毒載量的比較

2．2．2 按照血清HCV-RNA載量分為低病毒載量組＜105（log10 拷貝/ml）、中高病毒載量組＞105（log10拷貝/ml），1b型與非1b型例數(shù)及比例見表3。通過卡方檢驗(yàn)比較低病毒載量組與中高病毒載量組病人比例，結(jié)果 χ2=4．159，P＜0．05，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在低病毒載量比較中1b型病人所占比例小于非1b型，中高病毒載量比較中1b型病人比例大于非1b型。

表3 1b型與非1b型在不同病毒載量水平的病例數(shù)比較

3 討論

全球約有1．3億～2．1億人感染丙型肝炎病毒(HCV)，我國一般人群HCV感染率為0．43%，約有1300萬人口抗-HCV陽性，是世界上HCV感染人口數(shù)最多的國家。丙肝病毒是肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素之一，從全球范圍來看，至少有三分之一的肝細(xì)胞癌是由HCV引起的，每年約有35萬人死于丙肝相關(guān)疾病[5]，丙肝防治形勢(shì)嚴(yán)峻。

丙型肝炎病毒是單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科。由于該病毒為RNA病毒，易發(fā)生基因變異，根據(jù)核苷酸同源性分析，HCV遺傳變異性可分為6種基因型，每組基因型又分別可以分為多種基因亞型。因地域不同，HCV基因型在不同地區(qū)存在很大差異，基因分型不僅有助于了解相關(guān)HCV演變及流行分布，也有助于了解丙型肝炎的危險(xiǎn)因素以及肝臟疾病的進(jìn)展情況，HCV基因分型在流行病學(xué)研究和臨床治療上均有重要作用[6]。廣州地區(qū)最廣泛流行的丙型肝炎病毒分型是1b型，其次為6a型，1b型也是全世界最主要的流行類型，和世界大流行的環(huán)境相似；1b型的丙型肝炎易形成慢性肝炎，不易根治，并有可能發(fā)展成肝癌，對(duì)社會(huì)的危害性大[7]。廣州地區(qū)6a型丙型肝炎病毒流行是因?yàn)榕徬愀酆桶拈T，以及東南亞等6a型分布廣泛的地區(qū)，這些地區(qū)的人口與廣州地區(qū)相互交流頻繁，使廣州地區(qū)6a型丙型肝炎流行呈逐漸增加趨勢(shì)。6a類型的丙型肝炎較容易治愈，不容易發(fā)展成慢性肝炎[8]。因此，檢測(cè)HCV基因型有助于判斷治療的難易程度、制定個(gè)體化的資料方案[9]。

番禺地區(qū)2016年收集的125例丙型肝炎病毒陽性患者當(dāng)中，1b型為主要類型，占48．0%，肖桂娥等在廣州地區(qū)2014年檢測(cè)1b型比例為40．78%[10]，本次研究結(jié)果與廣州結(jié)果相近，也與廣東乃至全國平均水平相符。番禺地區(qū)丙型肝炎病毒基因6a型的比例達(dá)到了27．2%，高于全國平均水平，這是由于廣州番禺屬于東南沿海毗鄰香港，澳門以及東南亞6a類型廣泛流行的地區(qū)，人員交流頻繁導(dǎo)致。相比粵東地區(qū)2007-2010年6a型比例為17．9%，說明番禺與廣東其他地區(qū)情況類似但更為嚴(yán)重[11，12]。大量研究表明，1b型丙肝病毒導(dǎo)致的丙型肝炎在臨床上是較為難治的類型，這提醒我們番禺地區(qū)丙肝臨床治療形式不容樂觀。

由于本地區(qū)1b類型患者比例較大，且臨床上也較其他基因型容易轉(zhuǎn)變成為慢性丙肝難以治愈，因此我們主要研究1b型與非1b型之間的病毒載量差異[13，14]。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較1b型與非1b型患者血清HCV-RNA載量，結(jié)果顯示1b型與非1b型病毒載量之間差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1b類型的丙型肝炎病毒載量平均值為5．87±1．05（log10拷貝/ml）， 高于非 1b類型的平均值 5．36±1．34（log10 拷貝/ml）；另外通過對(duì) 1b 型與非 1b 型患者血清HCV-RNA在低病毒載量水平與中高病毒載量水平的人數(shù)比例作比較，用卡方檢驗(yàn)顯示1b型患者中高病毒載量水平的人數(shù)比例大于非1b型。從患者血清病毒載量方面反映番禺地區(qū)1b類型的丙型肝炎病人的病情要比非1b類型的嚴(yán)重，與臨床上1b類型較難治愈和易形成慢性肝炎的臨床特點(diǎn)相符[15]。

本次研究，了解到廣州番禺地區(qū)丙型肝炎病毒基因型的構(gòu)成特點(diǎn)和分析丙肝病毒基因型與病毒載量的相關(guān)性，結(jié)果提醒我們目前防治丙肝1b型形勢(shì)依然嚴(yán)峻，臨床應(yīng)根據(jù)不同基因型病毒特點(diǎn)制定個(gè)體化治療方案。

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