崔曉娜， 郭禮強(qiáng)， 葛愛民， 李 舫

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061； 2.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041)

通信作者：李 舫，女，碩士，教授，主要從事家禽生產(chǎn)中生物安全控制技術(shù)研究。E-mail：sdmylifang@163.com。

霉菌毒素對人和動物是有害的，是霉菌在被污染的食品或飼料中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，其不僅會對糧食、飼料等產(chǎn)生嚴(yán)重的污染，引起人、畜中毒或死亡，而且有些霉菌毒素還具有“三致”作用，嚴(yán)重危害了人畜的健康。霉菌毒素的污染主要來自于農(nóng)作物、飼料、食品的生產(chǎn)、加工及儲存等各個環(huán)節(jié)[1-2]。已發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素約有300種[3]，其中只有極少一部分被常規(guī)監(jiān)管及殘留監(jiān)控。因此，評估和篩查常用霉菌毒素在飼料及農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，對維護(hù)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展及保護(hù)消費(fèi)者的健康具有積極意義。

目前，在對多種霉菌毒素同時檢測的方法中以液相色譜法[4-5]和液相色譜-質(zhì)譜法[6-9]為常用的檢測方法，但因其選擇性差，很難對多種毒素同時檢測，且靈敏度也達(dá)不到要求。液相色譜-質(zhì)譜法方法的選擇性好，操作簡單省時，尤其是四極桿-飛行時間質(zhì)譜屬于高分辨質(zhì)譜，具有質(zhì)量范圍廣、高通量、高質(zhì)量精度和分辨率、分析全面等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)毒素準(zhǔn)分子離子的精確分子質(zhì)量對其進(jìn)行定性推導(dǎo)，顯著提高了復(fù)雜基質(zhì)下的抗干擾能力，而質(zhì)譜獲得的全掃描譜圖可以用于建立化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，因此，可以在不使用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下通過已有數(shù)據(jù)庫的信息對未知樣品中的化合物進(jìn)行定性判斷[10-12]。目前，國內(nèi)利用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜篩查飼料中霉菌毒素的報道較少，但該方法的開發(fā)利用具有良好的應(yīng)用前景。因此，本研究選擇易污染糧谷飼料的常見產(chǎn)毒霉菌代謝物為研究對象，建立17種霉菌毒素的一級和二級譜庫，并采用QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，簡稱QuEChERS)前處理提取方法，結(jié)合譜庫檢索建立飼料中17種霉菌毒素的快速高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，簡稱HPLC-Q-TOF/MS)測定方法，以期為企業(yè)及監(jiān)管部門提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Agilent 1290-6530高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(electrospray ionization，簡稱ESI)，購自美國Agilent公司；5810R離心機(jī)，購自德國Eppendorf公司；N-EVAP氮吹儀，購自美國Organomation Associates公司；Milli-Q超純水機(jī)，購自美國Millipore公司；KQ-500超聲波清洗器，購自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、橘青霉素、蛇形菌素、新茄鐮孢菌醇、疣孢青霉原標(biāo)準(zhǔn)品，均購自BioPure公司；O-甲基雜色曲霉素、雜色曲霉素、環(huán)匹阿尼酸、青霉酸、伏馬菌素(B1、B2)，購自Sigma公司。

中性氧化鋁，購自杭州永星五交化有限公司；石墨炭黑粉、C18粉、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，簡稱PSA)粉、氨丙基粉，均購自美國Agilent公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸，均為色譜純，均購自德國Merck公司；試驗用水為超純水。

將各標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，各50 mL，存儲期6個月；再用乙腈配制濃度為 100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品中間液，再根據(jù)實(shí)際需要用飼料提取液稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃保存，有效期3個月。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g均質(zhì)的試驗樣品置于50 mL離心管內(nèi)，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液(乙腈與水的體積比為 8 ∶2)，高速均質(zhì)1 min，以10 000 r/min離心10 min，取8 mL上清液于15 mL干凈的玻璃試管中，加入500 mg C18粉渦旋振蕩，靜置2 min后，取4 mL上層溶液于10 mL玻璃試管中，30 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? mL初始流動相溶液將其溶解，渦旋振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供HPLC-Q-TOF/MS分析測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為0.1%乙腈水溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，5% B；2～12 min，5%～80% B；12～16 min，80%～95% B；16～17 min，95%～5% B；平衡3 min。進(jìn)樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min。參比質(zhì)荷比范圍為121.050 9～922.009 8。

1.4 質(zhì)譜條件

氣體溫度為350 ℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力為310.26 kPa，電離方式為正離子模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式采集，數(shù)據(jù)儲存方式為柱狀圖，電壓為4 000 V，碰撞能量為 20 V。17種霉菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 17種霉菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)

1.5 譜庫建立

配制濃度為1 mg/L的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，在不同碰撞能量(0、10、20、40 V)下分別對目標(biāo)化合物進(jìn)行測定，采集所需數(shù)據(jù)，建立目標(biāo)化合物一級質(zhì)譜全掃描篩查庫和二級譜圖庫。通過譜庫檢索，以目標(biāo)化合物的一級質(zhì)譜精確分子量、保留時間、同位素豐度匹配、特征離子等信息進(jìn)行定性分析，同時填寫分子式和化學(xué)名稱等。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

飼料的基質(zhì)成分較復(fù)雜，提取溶劑的選擇對霉菌毒素回收率有重要影響。參考相關(guān)文獻(xiàn)，排除毒性較大的四氯化碳、含苯環(huán)溶劑后，本試驗先后采用甲醇、乙腈、異丙醇、甲醇水溶液[5]、乙腈水溶液[6-10，13]等5種溶液進(jìn)行提取。結(jié)果表明，僅以甲醇、乙腈、異丙醇為提取溶劑時，17種霉菌毒素的回收率在15%～45%之間；使用甲醇-水作為提取溶劑時，回收率在44%～60%之間；使用乙腈-水作為提取溶劑時，回收率在50%～80%之間，比甲醇-水作為提取溶劑時的回收率最低提高了6%，且基質(zhì)噪音更低，最終選用乙腈-水作為提取溶劑。同時考察了提取溶液的pH值對霉菌毒素回收率的影響，試驗發(fā)現(xiàn)在提取溶液中加入1%甲酸后，回收率和穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，推測一些霉菌毒素(伏馬菌素B1、赭曲霉素A等)在中性或堿性環(huán)境下易分解，酸性環(huán)境更有利于提取。為提高凈化效果，提高方法的靈敏度，本試驗進(jìn)一步考察了C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化鋁、PSA粉、氨丙基粉等5種QuEChERS凈化粉[14-15]對17種霉菌毒素的吸附回收率，通過在霉菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(15.0 μg/kg)中添加5種凈化粉，與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對比來計算吸附率。由表2可知，C18粉對17種霉菌毒素的吸附影響較低，目標(biāo)分析物的回收率為96.2%～114.5%，其他4種凈化粉對一些霉菌毒素的吸附較嚴(yán)重，達(dá)不到試驗要求。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對于飛行時間質(zhì)譜，相似目標(biāo)分析物基質(zhì)或同分異構(gòu)體對采集精確分子量數(shù)據(jù)影響較大，干擾譜庫的檢索，同時所測定的17種霉菌毒素母離子質(zhì)荷比在169～723之間(表1)，化學(xué)性質(zhì)相差很大，這些對色譜條件都提出了一定要求。試驗考察了甲醇和乙腈2種有機(jī)流動相對目標(biāo)分析物的影響，發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇-水時，疣孢青霉原的峰形偏寬，靈敏度偏低；黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B2的保留時間相差不大，干擾二級碎片離子分析。調(diào)整流動相為乙腈-水[6]，經(jīng)多次試驗最終確定了“1.2”節(jié)中所述流動相比例及梯度洗脫條件，應(yīng)用該方法時基線平穩(wěn)，各目標(biāo)物能有效分離，目標(biāo)分析物的一級、二級譜圖響應(yīng)值較好。

表2 經(jīng)C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化鋁、PSA粉、氨丙基粉等5種凈化粉吸附后17種霉菌毒素的回收率

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

高分辨質(zhì)譜篩查流程簡單、通量高，非常適合做目標(biāo)分析物和未知樣品的篩查，對于已知化合物可以通過其標(biāo)準(zhǔn)品建立化合物的一級、二級譜圖庫，從而在未知樣品質(zhì)譜掃描后提取質(zhì)譜信息，通過譜圖庫比對結(jié)果，直接對化合物進(jìn)行定性、定量分析，從而提高檢測者的工作效率。將目標(biāo)化合物分別配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用HPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，以黃曲霉毒素B1(精確質(zhì)荷比為329.065 7)為例，如圖1所示，通過譜庫檢索，可以初步推斷化合物的精確分子量、分子式、同位素峰等信息。統(tǒng)計17種霉菌毒素的保留時間和質(zhì)譜信息(表1)，建成質(zhì)譜庫，包含保留時間、母離子、子離子、結(jié)構(gòu)式等。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

對17種霉菌毒素質(zhì)量濃度在1.0～200.0 μg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(用飼料基質(zhì)提取液配制)進(jìn)行測定，以各目標(biāo)分析物峰面積的平均值(y)與其質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)均大于0.990(表3)。在飼料基質(zhì)中添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以信噪比為3作為方法的檢出限，以信噪比為10作為方法的定量下限。由表3可知，17種霉菌毒素的檢出限為0.5～3.0 μg/kg，定量下限為1.0～10.0 μg/kg 。

2.5 實(shí)際樣品的測定

對市場購買的20份飼料(全價飼料和玉米粉各10份)中的霉菌毒素含量進(jìn)行測定，在1份玉米粉樣品中檢出黃曲霉毒素B2，含量為4.1 μg/kg。如圖2所示，其中圖2-a為疑似黃曲霉毒素B2提取離子流圖，圖2-b為通過譜庫檢索疑似樣品和譜庫匹配后提供的精確分子量信息，由此推斷為黃曲霉毒素B2。為了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，引用質(zhì)檢總局霉菌毒素行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[16]對陽性樣品進(jìn)行驗證，檢測結(jié)果為 4.3 μg/kg，小于國家標(biāo)準(zhǔn)(5.0 μg/kg)，與篩查檢測結(jié)果比較吻合。

3 結(jié)論

本試驗使用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合液相色譜-飛行時間質(zhì)譜快速篩查了飼料中17種常見霉菌毒素，在無需標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，通過譜庫檢索，能夠同時實(shí)現(xiàn)對飼料中17種霉菌毒素的定性、定量分析。通過對提取溶劑、QuEChERS凈化粉、色譜質(zhì)譜條件等進(jìn)行優(yōu)化研究，提高了該方法的靈敏度和通用性，可以滿足飼料中常見霉菌毒素殘留檢測的需求。

表3 17種霉菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量下限

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