狄伶

上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海 200240

引言

顯微成像技術(shù)是一種借助物理方法觀察微小物體的技術(shù)手段，它的發(fā)展與物理學(xué)領(lǐng)域?qū)獾恼J(rèn)識(shí)密不可分。1837年，德國(guó)科學(xué)家Abbe[1]揭示了遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡在光的衍射效應(yīng)和有限孔徑分辨率的制約下能夠獲得的最小分辨率不超過(guò)200 nm，這一衍射極限使傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無(wú)法對(duì)微小物體進(jìn)行更精微的觀察。在近代生命科學(xué)領(lǐng)域，尤其是神經(jīng)生物學(xué)和遺傳發(fā)育等學(xué)科，備受關(guān)注的生理活動(dòng)更多發(fā)生在幾個(gè)到幾百納米水平，很多亞細(xì)胞器、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生物大分子以及細(xì)胞膜內(nèi)部的生理活動(dòng)很難被傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡捕捉到。盡管改變光源可以大幅提升分辨率，但由此發(fā)展出的電子顯微成像技術(shù)只適于觀察已被固定的物體，無(wú)法實(shí)時(shí)觀察活的生命現(xiàn)象。為了在生命領(lǐng)域得到更真實(shí)的觀察，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)聯(lián)用光電技術(shù)的飛速發(fā)展，激光掃描共聚焦顯微鏡以及各種超分辨顯微成像技術(shù)逐漸被開發(fā)，這些技術(shù)不僅在分辨率上實(shí)現(xiàn)了對(duì)衍射極限的突破，更在多維度上實(shí)現(xiàn)了對(duì)生命現(xiàn)象的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)捕捉，成為分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是神經(jīng)生物學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)和生理學(xué)等學(xué)科的重要觀察手段[2-4]。

本文主要介紹顯微成像技術(shù)中的熒光成像、共聚焦顯微成像和超分辨顯微成像技術(shù)；在超分辨顯微成像技術(shù)部分，主要介紹受激發(fā)射損耗（Stimulated Emission Depletion，STED）技術(shù)。

1 光學(xué)顯微成像

1.1 常用顯微技術(shù)

顯微鏡根據(jù)成像方式可以分為光學(xué)顯微鏡、共聚焦顯微鏡和體視顯微鏡[5]，其中體視顯微鏡因?yàn)樵谟^察過(guò)程中可使用器械微操作又被稱作解剖鏡，在實(shí)驗(yàn)室中常被用于樣品的前處理，例如植物組織（花蕊、花藥）的剖出等。光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡廣泛應(yīng)用于近代生命科學(xué)領(lǐng)域，觀察并記錄各種生命現(xiàn)象，由此發(fā)展出一系列有學(xué)科針對(duì)性的顯微成像技術(shù)：借助結(jié)構(gòu)光和圖像的重構(gòu)算法得到超高分辨圖像的結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）可以開展活細(xì)胞的超高分辨觀察[6-7]；使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以動(dòng)態(tài)的檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用[8]；使用多光子顯微成像技術(shù)可獲得厚樣本的三維成像，例如捕捉腦組織深層神經(jīng)元及軸突的空間分布[9]。

基于光學(xué)顯微鏡的常用顯微成像技術(shù)有：明場(chǎng)成像、暗場(chǎng)成像、偏光成像、熒光成像、相襯成像、微分干涉成像和調(diào)制對(duì)比成像等?；诠簿劢癸@微鏡的常用顯微技術(shù)有：熒光成像、全內(nèi)反射成像、超分辨顯微成像和多光子顯微成像等。明場(chǎng)成像、暗場(chǎng)成像、偏光成像和熒光成像主要反映形貌信息，而相襯成像、微分干涉成像和調(diào)制對(duì)比成像主要反映標(biāo)本結(jié)構(gòu)中的相位變化[4]。全內(nèi)反射成像主要用于觀察位于或接近細(xì)胞質(zhì)膜的變化[10]；多光子顯微成像在深度觀察方面優(yōu)于單光子；而超分辨顯微成像在分辨率要求比較高的實(shí)驗(yàn)中更有優(yōu)勢(shì)[11-12]。在所有技術(shù)中，熒光成像是最常用的成像技術(shù)。

1.2 熒光成像

熒光成像是一種落射光照明的成像技術(shù)，光源通常為汞燈或發(fā)光二極管，熒光光源通過(guò)落射照明光路由分光棱鏡入射到物鏡，然后由濾光片濾出一定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光，熒光再經(jīng)截止濾光片阻擋，只濾出一定波段的熒光返回物鏡通過(guò)鏡筒透鏡成像。由于激發(fā)光和被激發(fā)熒光之間有波長(zhǎng)差，使得截止濾光片可以選出被激發(fā)熒光，同時(shí)截止激發(fā)光[4]。

使用熒光成像技術(shù)的樣品需要滿足一個(gè)基本條件，即樣品待觀察部位能被一定波長(zhǎng)的光激發(fā)出熒光。常規(guī)做法是選擇合適的熒光染色劑（染料）對(duì)樣品待觀察的部位進(jìn)行熒光標(biāo)記，使用單一染料或聯(lián)合多種染料標(biāo)記出待觀察部位。如果樣品本身存在自發(fā)熒光，需要在選擇熒光染料時(shí)多加考慮，盡可能避開不想觀察區(qū)域自發(fā)熒光的干擾。在染料的選擇和使用中，尤其是進(jìn)行多重標(biāo)記時(shí)，要盡量避免染料之間串色，使用不同種屬來(lái)源的抗體進(jìn)行染色時(shí)優(yōu)先選擇穩(wěn)定性和抗淬滅性強(qiáng)的染料。目前市場(chǎng)上有很多技術(shù)成熟的染料公司可供選擇，比如Sigma公司。各大儀器公司的主頁(yè)也會(huì)有相應(yīng)的染料光譜數(shù)據(jù)以供參考。在做特殊要求的實(shí)驗(yàn)時(shí)，比如超高分辨觀察，使用技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)自行開發(fā)的染料將獲得更高的成像效果和分辨率。

2 共聚焦顯微成像

2.1 單光子（共焦）顯微成像

單光子（共焦）顯微成像技術(shù)中，所謂單光子就是用一個(gè)光子激發(fā)一個(gè)熒光分子，激發(fā)光波長(zhǎng)一般短于發(fā)射光波長(zhǎng)，而多光子是用兩個(gè)或多個(gè)光子激發(fā)一個(gè)熒光分子，激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)于發(fā)射光波長(zhǎng)。在日常工作中，共聚焦顯微成像系統(tǒng)最常配備的激光器是單光子激光器，最常用的熒光激發(fā)方式是單個(gè)光子激發(fā)，因此我們通常所說(shuō)的共聚焦顯微成像就是單光子（共焦）顯微成像。多光子激光器可以獨(dú)立配置于一臺(tái)共聚焦顯微系統(tǒng)上，也可以和單光子激光器共同配置于共聚焦上，使用時(shí)由常用的單光子模式切換到多光子模式， 即可開展多光子（共焦）顯微成像觀察。單光子（共焦）顯微成像技術(shù)與多光子（共焦）顯微成像技術(shù)的主要區(qū)別在于使用的激光器不同，成像系統(tǒng)和圖像采集系統(tǒng)都基于共聚焦顯微成像系統(tǒng)，因此這兩個(gè)成像技術(shù)都屬于共聚焦顯微成像技術(shù)體系，具有共聚焦顯微成像系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。

對(duì)于光學(xué)顯微鏡來(lái)說(shuō)，深度成像和提高分辨率很難同時(shí)實(shí)現(xiàn)，尤其在高倍率下這一矛盾更為突出，共聚焦顯微成像系統(tǒng)的點(diǎn)光源優(yōu)勢(shì)和對(duì)非焦平面散射光的屏蔽作用可以很好的解決這一問(wèn)題。共聚焦顯微成像系統(tǒng)的光源是激光，相比光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的普通光源它的單色性和相干性更好，激光光束沿光路以點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的掃描方式逐一聚焦于樣品焦平面某點(diǎn)，激發(fā)樣品發(fā)射熒光，發(fā)射光經(jīng)檢測(cè)針孔被光電倍增管所采集，最后由計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化形成熒光圖像[5,12]。這種點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的掃描方式和針孔對(duì)非焦平面以及焦平面上的非焦點(diǎn)光斑信息的阻隔，能有效提高圖像在各深度下的分辨率和清晰度。共聚焦掃描系統(tǒng)沿z軸上下移動(dòng)形成的一系列共焦平面，經(jīng)軟件整合為三維圖像，還能更加立體直觀的呈現(xiàn)樣品深層信息，例如特殊合成的小分子或具有靶向性/特異性的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)三維重構(gòu)可以直觀的看到材料在亞細(xì)胞器不同焦平面和部位的分布，判斷材料是否進(jìn)入或僅表覆于亞細(xì)胞器。

熒光強(qiáng)度與特異性熒光標(biāo)記蛋白的表達(dá)量成正相關(guān)，可以通過(guò)分析樣品的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定量分析（圖1）。使用多位點(diǎn)長(zhǎng)時(shí)間序列掃描，可以動(dòng)態(tài)記錄活細(xì)胞生理過(guò)程，例如藥物對(duì)亞細(xì)胞器的靶向?qū)嶒?yàn)中，藥物分子進(jìn)入細(xì)胞的變化曲線、藥物分子與亞細(xì)胞器的空間分布以及細(xì)胞活性狀態(tài)的變化可以在一次觀察中獲得。多位點(diǎn)采集可以在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上提高數(shù)據(jù)的可靠性。對(duì)于比較大的樣本，例如植物組織或小鼠腦片，使用自動(dòng)拼接功能結(jié)合z軸層掃，可以得到整個(gè)樣本的立體信息，獲得更豐富的有效信息。

圖1 熒光定量分析

2.2 多光子（共焦）顯微成像

在腦神經(jīng)科學(xué)和植物學(xué)等領(lǐng)域，對(duì)樣本實(shí)現(xiàn)深度觀察是一個(gè)最基本的實(shí)驗(yàn)要求[13]。常用的光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡受限于光源很難實(shí)現(xiàn)深度超過(guò)100 μm的觀察，多光子顯微成像技術(shù)采用長(zhǎng)波激發(fā)光（穿透深度比單光子激光器深）[14]，以脈沖激光的方式使兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)被激發(fā)的電子，穿透深度可達(dá)1 mm，因此在實(shí)現(xiàn)組織深層次成像方面有很大的優(yōu)勢(shì)。結(jié)合樣品的透明化處理，多光子顯微成像可以得到很好的成像效果，例如上海交通大學(xué)李小衛(wèi)等[12]研究的透明腦塊三維重構(gòu)圖（圖2）可以提供樣本深處神經(jīng)元和軸突的分布及走向，進(jìn)行直接分析。

圖2 透明腦塊三維重構(gòu)圖

在實(shí)際的工作中，多光子顯微成像系統(tǒng)觀察的樣品一般都比較大、厚或是動(dòng)物等個(gè)體級(jí)別，正置的顯微成像系統(tǒng)相對(duì)于倒置的顯微成像系統(tǒng)會(huì)更有優(yōu)勢(shì)一些，尤其在開展小動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)時(shí)，麻醉小鼠安放在正置顯微成像系統(tǒng)下更便捷，小鼠腦部的開放創(chuàng)口也更易于被固定，保持實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被激光照射后穩(wěn)定不動(dòng)。此外，在材料科學(xué)部分領(lǐng)域，尤其是合成藥物分子等研究方向，材料自身的激發(fā)光譜較寬，材料對(duì)長(zhǎng)、短波長(zhǎng)的需求各異。檢測(cè)平臺(tái)或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)常配的單光子激光器波長(zhǎng)范圍一般在405～775 nm，材料很難得到充分激發(fā)。常配的多光子激光器波長(zhǎng)范圍一般在680～1080 nm并且連續(xù)可調(diào)，可以很好的滿足長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光的需求。根據(jù)雙光子的激發(fā)原理，被激發(fā)的熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，這個(gè)效果與使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的，也就是說(shuō)采用兩倍單光子激發(fā)波長(zhǎng)也可達(dá)到激發(fā)條件，這就可以很好的滿足需要波長(zhǎng)較短的材料。在觀察時(shí)對(duì)兩倍單光子激發(fā)波長(zhǎng)左右一段范圍內(nèi)逐一激發(fā)再確認(rèn)，或者在這段范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，可以找到最優(yōu)的激發(fā)波長(zhǎng)?；旧线@類寬范圍激發(fā)光譜的材料都能使用多光子獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此多光子顯微成像也逐漸被越來(lái)越多的材料科學(xué)所關(guān)注并使用。活體動(dòng)物雙光子顯微成像，見圖3。

圖3 活體動(dòng)物雙光子顯微成像

3 超分辨顯微成像

光學(xué)衍射極限的概念基于光的波動(dòng)本性，遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡受限于光學(xué)衍射極限，分辨率僅能達(dá)到可見光波長(zhǎng)的一半左右（約200 nm），而對(duì)于生命科學(xué)領(lǐng)域所關(guān)注的生理活動(dòng)，往往需要分辨率達(dá)到幾十納米甚至更微小。為了提高分辨率，早期的研究主要集中在對(duì)光源和光學(xué)物理元件的探索，例如減小光的波長(zhǎng)（典型代表是電子顯微鏡）、使用共焦小孔減小艾里斑尺寸（典型代表是共聚焦顯微鏡）、設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的光學(xué)收集系統(tǒng)增加有效孔徑角（典型代表是4Pi顯微鏡）等。近代對(duì)于光學(xué)顯微技術(shù)的探索，主要借助于光與物質(zhì)相互作用中產(chǎn)生的各種效應(yīng)[15]。2014年美國(guó)Eric Betzig/William E. Moerner的光激活定位顯微技術(shù)（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）及異曲同工的德國(guó)Stefan W. Hell的STED技術(shù)同獲諾貝爾獎(jiǎng)，突破了光學(xué)顯微成像的衍射極限并革新了超分辨顯微成像術(shù)的歷史[16]。

目前超分辨顯微成像技術(shù)主要分為兩類[17-23]：一類是基于調(diào)制照明光斑以縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的超分辨技術(shù)：其代表是STED技術(shù)以及在STED技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步延展的可逆飽和光熒光轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)和基態(tài)損耗技術(shù)；另一類是基于單分子定位的超分辨顯微成像技術(shù)：主要代表是PALM技術(shù)、隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)、以及熒光活化定位顯微技術(shù)。除了這兩類主流的超分辨顯微成像技術(shù)，還有一類重要的活細(xì)胞超分辨顯微成像技術(shù)，它是基于結(jié)構(gòu)照明原理的SIM技術(shù)。

目前，這些超分辨顯微成像技術(shù)已由各大顯微鏡品牌公司應(yīng)用于各自的產(chǎn)品中，而STED技術(shù)的發(fā)明人Stefan Hell教授團(tuán)隊(duì)自創(chuàng)顯微鏡品牌公司Abberior Instruments，獨(dú)立開發(fā)并不斷拓展、更新這一技術(shù)在實(shí)際工作中的應(yīng)用。關(guān)于STED技術(shù)，我們可以理解為兩束具有同軸光路的激光共同作用于一個(gè)位點(diǎn)，一束用于激發(fā)熒光物質(zhì)得到熒光（圓斑狀），另一束環(huán)狀激光使圓斑外周部分區(qū)域受激發(fā)射（圓環(huán)狀），中心無(wú)重合的熒光區(qū)域被采集，兩束激光重合的受激發(fā)射區(qū)域被濾光片阻擋，從而獲得尺寸更小的光斑。這個(gè)技術(shù)通過(guò)控制環(huán)狀激光的大小提升分辨率，當(dāng)無(wú)重合區(qū)域足夠小時(shí)，分辨率能得到極大的提高。配合白激光的使用，xy平面分辨率可以達(dá)到50 nm以下，z軸分辨率130 nm以下，比共聚焦的分辨率有顯著提升，能夠獲得更多有效科學(xué)信息（圖4）[24-25]。

圖4 電紡絲顯微成像圖

Abberior團(tuán)隊(duì)近年在STED技術(shù)基礎(chǔ)上繼續(xù)開發(fā)的超分辨顯微成像系統(tǒng)在分辨率上有進(jìn)一步提高，XY平面分辨率可以達(dá)到20 nm以下，Z軸分辨率30～45 nm以下，3D分辨率可達(dá)到70 nm×70 nm×70 nm，稍有遺憾的是這一技術(shù)暫時(shí)無(wú)法開展時(shí)間序列掃描。

4 總結(jié)

顯微成像技術(shù)隨著學(xué)科交叉的日益密集在不斷發(fā)展，一系列具有學(xué)科針對(duì)性的特色技術(shù)逐漸被開發(fā)并使用。操作系統(tǒng)的設(shè)計(jì)更加便捷，使更多不同學(xué)科背景的科研工作者能夠快速掌握并開展工作。圖像的采集和分析更貼近學(xué)科和研究方向，使檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果不僅簡(jiǎn)明直觀，而且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。技術(shù)層面更加深入解決科研需求，使觀察得以更微小、采集得以更快速、探索得以更深層、捕捉得以更穩(wěn)定持久。多學(xué)科背景研發(fā)團(tuán)隊(duì)的融合，從染料研發(fā)到顯微成像系統(tǒng)的開發(fā)，從后續(xù)算法解析到平臺(tái)控制軟件，包括系統(tǒng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，都在進(jìn)一步被關(guān)注并完善，21世紀(jì)的顯微成像技術(shù)必將為各學(xué)科的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。

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