劉朝顯 王久光 梅秀鵬 余婷婷 王國強 周 練 蔡一林

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玉米胚乳母本印記基因的克隆及印記特性分析

劉朝顯**王久光**梅秀鵬 余婷婷 王國強 周 練 蔡一林*

西南大學玉米研究所 / 南方山地農業(yè)教育部工程研究中心, 重慶 400715

印記基因在玉米籽粒發(fā)育中具有重要作用。玉米是母本印記基因。本研究通過RACE擴增, 獲得了基因的cDNA全長, 約2.2 kb, 編碼598個氨基酸。根據對B73和Mo17正反交授粉后14 d胚乳和胚中等位基因的表達分析, 該基因僅在玉米胚乳中表現(xiàn)母本印記, 而在胚中則無印記現(xiàn)象。在鄭58和昌7-2、黃C和178、PH6WC和PH4CV正反交14 d胚乳中也表現(xiàn)印記, 因此該基因為基因特異性的二元印記。在B73、Mo17正反交授粉后12~28 d胚乳中處于持續(xù)印記狀態(tài)。組織表達模式研究表明在營養(yǎng)生長和生殖生長階段均有表達;在玉米授粉后10 d籽粒、雌穗、雄穗、花絲中表達量較高, 其次是根、胚珠及授粉后25 d的胚中, 推測在玉米籽粒及花發(fā)育過程中均具有重要功能。

; 基因克隆; 基因印記; 印記模式

基因組印記是一種表觀遺傳學現(xiàn)象, 在動植物中普遍存在。印記基因在DNA序列上沒有發(fā)生任何變化, 等位基因的表達水平因其親本來源的不同(父本或者母本)而表現(xiàn)出較大的差異[1], 即來自某一親本的等位基因表達, 而來自另一親本的等位基因不表達或者表達量極低。根據印記基因的親本來源可將印記基因分為父本印記(來自父本的等位基因表現(xiàn)印記)和母本印記(來自母本的等位基因表現(xiàn)印記), 根據印記基因的印記特性可分為等位基因特異性印記(某些等位基因表現(xiàn)印記)和基因特異性印記(所有等位基因表現(xiàn)印記), 根據印記基因的表達特性可分為二元印記(2個等位基因中只有一個表達, 而另一個則完全沉默)和差異印記(2個等位基因都表達, 其中一個表達量較高, 一個較低)及持續(xù)性印記(在一個較長的時間段均表現(xiàn)印記)和瞬時印記(只在其中一個時間點或者極短的時間段表現(xiàn)印記)[2]。

印記基因首先是在植物中發(fā)現(xiàn)的。是在20世紀70年代初發(fā)現(xiàn)的第一個印記基因, 該基因調控玉米籽?；ㄉ盏暮铣?。當父本遺傳時, 玉米籽粒呈斑駁狀著色; 然而當母本遺傳時, 則整個玉米籽粒著色[3]。20世紀80年代, 對小鼠進行細胞核移植時證實了哺乳動物中也存在基因印記現(xiàn)象。核移植實驗結果表明雙親貢獻的基因組遺傳信息并不完全相同, 只有同時具有來源于雙親染色體的胚胎才能存活下來; 僅擁有父本基因組或母本基因組的二倍體胚胎均不能完成發(fā)育過程[4-5]。隨后在哺乳動物中鑒定出了越來越多的印記基因, 且其功能得到了闡釋[6]。研究結果發(fā)現(xiàn)哺乳動物中印記基因功能通常比較保守, 在胚胎生長發(fā)育中具有重要作用?，F(xiàn)已闡明印記基因調控哺乳動物胎盤發(fā)育、胎兒發(fā)育、胎兒后天行為及代謝等過程, 并且印記基因甲基化狀態(tài)的改變可能會導致疾病[7-8]。

相對哺乳動物基因組印記的研究, 植物基因組印記研究較滯后。目前在擬南芥、水稻、玉米等植物中均鑒定出了大量的印記基因[9-11]。玉米是異花授粉植物, 籽粒較大且胚乳持續(xù)存在, 因此在基因組印記研究中具有獨特優(yōu)勢。玉米中除了印記基因外, 在隨后研究中陸陸續(xù)續(xù)鑒定出了幾個印記基因, 其中包括父本印記基因[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、、[18]等。相對于數量較多的父本印記基因, 母本印記基因數量較少[19-20]。然而在21世紀初, 隨著轉錄組測序技術的發(fā)展, 玉米印記基因的數量急劇增加。Waters等[11]對B73、Mo17正反交授粉后14 d的胚乳和胚進行轉錄組深度測序, 共鑒定出了100個印記基因, 其中包括54個父本印記基因、46個母本印記基因。Zhang等[21]同樣利用轉錄組測序技術, 以B73、Mo17為材料, 對正反交授粉后10 d的胚乳和胚的基因表達譜進行分析, 鑒定出了179個編碼蛋白的印記基因, 其中111個是母本印記基因, 68個是父本印記基因; 此外還鑒定出了38個印記的長鏈非編碼RNA。(GRMZM2G339820)就是其中被鑒定的印記基因之一。是擬南芥的同源基因, 然而該基因的全長、基因的印記特性及時空表達模式尚不清楚。本研究通過快速擴增cDNA末端技術(RACE, rapid amplification cDNA ends)獲得了該基因的cDNA全長; 研究了該印記基因在幾個優(yōu)良雜交種中的印記模式及對該基因的時空表達模式進行分析, 從而為研究該基因在玉米籽粒發(fā)育中的功能及其參與的基因表達調控網絡奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和試劑

玉米自交系B73、Mo17、黃C、178、鄭58、昌7-2、PH6WC、PH4CV、大腸桿菌() DH5a均由本實驗室保存。植物總RNA提取試劑TRIzol、質粒提取試劑盒(TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit)、膠回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)購于天根生化科技(北京)有限公司; RNA反轉錄試劑盒(RevertAid RT Reverse Transcription Kit)和限制性內切酶購于Fermeantas公司; pEASY-T1載體、HiFi DNA 聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司; RACE試劑盒購自Clontech公司。

1.2 不同雜交組合授粉后不同階段胚及胚乳的分離

將玉米自交系B73、Mo17、黃C、178、鄭58、昌7-2、PH6WC、PH4CV于2013年種植于西南大學重慶歇馬基地。玉米散粉期, 分別對B73和Mo17、鄭58和昌7-2、黃C和178、PH6WC和PH4CV做正反交, 剝離鄭58和昌7-2、黃C和178、PH6WC和PH4CV正反交授粉后14 d胚乳及B73和Mo17正反交授粉后14 d胚; 每隔2 d一次剝離B73和Mo17正反交組合授粉后10~28 d胚乳, 于液氮中速凍,-80oC儲藏用于RNA提取。

1.3 快速擴增cDNA末端

1.3.1 5′RACE模板cDNA的制備 吸取2.75 μL授粉后14 d的B73胚乳RNA (523 mg L–1)及1 μL 5￠-CDS Primer A (12 μmol L–1)至0.2 mL無RNA酶離心管中, 混勻, 短暫離心, 收集溶液于管底。將離心管置PCR儀上, 72oC 3 min, 42oC 2 min。14 000′, 離心10 s收集溶液于管底。加入1 μL SMART II A Oligonucleotide (12 μmol L–1), 混勻并短暫離心, 收集溶液于管底。然后依次加入各反應組分, 混勻, 短暫離心, 收集反應液于管底。然后再加入5′First- Strand buffer 2.0 μL、DTT (20 mmol L–1) 1.0 μL、dNTP Mix (10 mmol L–1) 1.0 μL、RNase Inhibitor (4′107U L–1) 0.25 μL、SMARTScribe Reverse Transcriptase (1′108U L–1)1.0 μL。將上述反應液混勻, 短暫離心, 在PCR反應儀中42oC 90 min, 然后70oC 10 min。最后加入100 μL pH 8.0的TE緩沖液稀釋,-20oC保存。

1.3.2 3￠RACE模板cDNA的制備 吸取3.75 μL授粉后14 d的B73胚乳RNA (480 mg L–1)及1 μL 3￠-CDS Primer A (12 μmol L–1)至0.2 mL無RNA酶離心管中, 混勻, 短暫離心, 收集溶液于管底。將離心管置PCR儀上, 72oC 3 min, 42oC 2 min。14 000′, 離心10 s收集溶液于管底。然后再加入5′First-Strand buffer 2.0 μL、DTT (20 mmol L–1) 1.0 μL、dNTP Mix (10 mmol L–1) 1.0 μL、RNase Inhibitor (4′107U L–1) 0.25 μL、SMARTScribe Reverse Transcriptase (1′108U L–1) 1.0 μL。將上述反應液混勻, 短暫離心, 在PCR反應儀中42oC 90 min, 然后70oC 10 min。最后加入100 μL pH 8.0的TE緩沖液稀釋,-20oC保存。

1.4 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)標記的開發(fā)

設計基因特異性引物, 對B73、Mo17、黃C、178、鄭58、昌7-2、PH6WC和PH4CV cDNA進行擴增。將PCR產物連接到pEASY-T1載體, 轉化DH5a感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆送華大基因公司測序。然后用SNP2CAPS軟件[22]對B73和Mo17、鄭58和昌7-2、黃C和178、PH6WC和PH4CV之間的測序結果進行分析, 開發(fā)CAPS標記。

1.5 ZmVIL1的組織特異性表達分析

根據在玉米染色體的物理位置, 在qTeller (http://www.qteller.com/qteller4/)下載在根、頂端分生組織、葉、葉舌、葉鞘、雄穗、雌穗、花藥、花粉、花絲、胚珠、授粉后5 d和10 d籽粒、授粉后25 d胚和胚乳中的表達豐度RPKM值(每百萬reads中來自某基因每千堿基長度的reads數), 分析該基因在各組織中的表達。

1.6 系統(tǒng)進化樹的構建

擬南芥VIN3 (AT5G57380)、VIL1 (AT3G24440)、VIL2 (AT4G30200)、VIL3 (AT2G18880)和VIL4 (AT2G18870)蛋白序列下載于TAIR數據庫(http:// www.arabidopsis.org/index.jsp)。

根據蛋白序列號從NCBI網站下載(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)水稻OsVIL1、OsVIL2、OsVIL3和OsVIL4[23]。將目標序列導入MEGA6[24], 以默認參數利用CLUSTALW對導入序列比對, 隨后以NJ算法1000次重復構建系統(tǒng)發(fā)育樹[25]。

2 結果與分析

2.1 ZmVIL1 基因cDNA的克隆

2.1.1cDNA 5￠和3￠RACE 根據Gramene (http://ensembl.gramene.org/)預測的基因CDS序列, 分別設計了5￠RACE和3￠RACE巢式引物(表1), 利用B73授粉后14 d籽粒胚乳RNA反轉錄合成的5￠RACE和3￠RACE 全長 cDNA作為模板進行PCR擴增。如圖1-A所示, 分別用-5￠race和-3￠race引物對基因的5￠和3￠全長cDNA模板擴增后, 電泳結果顯示非特異性擴增條帶較多。因此分別用5￠和3￠RACE巢式引物-5￠race-nest-1和-3￠race-nest-1以第1輪RACE 產物稀釋50倍后, 吸取1 μL作為模板進行第2輪RACE。電泳結果顯示基因第2輪5￠RACE PCR產物非特異性擴增條帶仍然較多; 3￠RACE雖然主帶清晰, 但是PCR產物濃度較低(圖1-B)。因此又通過第3輪RACE巢式引物-5￠race-nest-2和- 3￠race-nest-2, 以第2輪RACE產物同樣稀釋50倍后吸取1 μL PCR產物作為模板進行擴增。結果顯示5￠RACE產物有清晰的主帶, 但基因非特異性擴增依然存在(圖1-C)。根據預測的基因CDS序列及RACE引物的位置, 推測第3輪5￠RACE產物大于700 bp, 因此參照分子量標準回收700 bp以上的條帶; 第3輪3￠RACE產物主帶清晰, 因此回收500 bp左右主帶。并分別將回收的5￠RACE和3￠RACE條帶連接到克隆載體上進行DNA測序。

2.1.2基因全長的獲得及預測編碼蛋白

以獲得的基因5￠RACE和3￠RACE序列為模板設計引物-CDS (表1)以B73授粉后14 d胚乳cDNA為模板進行擴增, 連接到克隆載體上, 挑選陽性克隆送測序。將獲得的測序序列與Gramene預測的基因cDNA序列比對, 然后選擇基因5￠RACE、3￠RACE的正確序列和-CDS擴增序列拼接, 從而獲得基因cDNA全長。序列分析結果顯示該基因cDNA全長2201 bp, CDS長1797 bp; 編碼蛋白由598個氨基酸組成(GenBank ID: MF437288)。ZmVIL1與擬南芥同源蛋白VIN3[26]和VIL1[27]序列比對表明, ZmVIL1和其他蛋白一樣都具有保守的鋅指蛋白和纖連蛋白結構域(圖2)。

表1 ZmVIL1 5￠ RACE、3￠ RACE、CDS擴增及印記特性分析引物序列

圖1 ZmVIL1基因5￠ RACE和3￠ RACE

A、B、C:第1輪、第2輪和第3輪RACE產物電泳。L1、L3、L5:cDNA 5￠RACE產物電泳; L2、L4、L6:cDNA 3￠RACE產物電泳; Marker: D2000 plus。

A, B, C: the gel electrophoresis for the first, second and third round RACE PCR products. L1, L3, L5: the gel electrophoresis for ZcDNA 5￠RACE; L2, L4, L6: the gel electrophoresis for ZcDNA 3￠RACE; Marker: D2000 plus.

2.2 ZmVIL1印記特性鑒定的CAPS標記開發(fā)

CAPS標記是鑒定印記基因印記特性的重要工具, 該標記成功開發(fā)與否依賴于DNA序列之間是否有豐富的單核苷酸多態(tài)性。在已獲得B73全長cDNA序列的基礎上, 利用-CDS對Mo17授粉后14 d胚乳cDNA進行擴增, 并對PCR產物克隆測序, 獲得了Mo17等位基因完整的CDS序列(GenBank ID: MF573938)。比對B73和Mo17CDS序列, 發(fā)現(xiàn)在CDS序列中的3個位點, 即第1380、第1450和第1530堿基有單核苷酸多態(tài)性(圖3), 并且內切酶I能識別B73第1380和第1450堿基周圍DNA序列, 然而在Mo17等位基因CDS序列中沒有I的識別位點。因此設計-imprinting引物(表1)用于擴增包括1380和1450單核苷酸多態(tài)性位點的DNA片段, 然后用內切酶I對擴增產物進行酶切, 從而區(qū)別B73和Mo17的等位基因。利用相同的方法, 用-imprinting對黃C、178、鄭58、昌7-2、PH6WC和PH4CV授粉后14 d胚乳cDNA進行擴增測序, 發(fā)現(xiàn)黃C、昌7-2和PH6WC中等位基因擴增片段同樣存在與B73一樣的I識別位點, 而在178、鄭58和PH4CV擴增片段中沒有該酶的識別位點。

2.3 ZmVIL1在B73和Mo17正反交授粉后14 d胚乳及胚中的印記特性分析

分離B73、Mo17、B73′Mo17 (B′M)、Mo17′B73 (M′B)授粉后14 d的胚乳及胚, 提取RNA反轉錄合成cDNA第1鏈。用-imprinting分別擴增B73、Mo17、B′M、M′B授粉后14 d的胚和胚乳cDNA, 用I對PCR產物酶切之后進行電泳檢測。結果顯示在B′M、M′B胚乳中, 來自母本的等位基因完全不表達, 而來自父本的等位基因表達(圖4-A), 因此在胚乳中表現(xiàn)為母本印記; 然而在胚中來自父本和母本的等位基因均正常表達(圖4-B), 因此在胚中并不表現(xiàn)印記現(xiàn)象。

2.4 ZmVIL1在黃C和178、鄭58和昌7-2、PH6WC和PH4CV正反交授粉后14 d胚乳中的印記特性分析

分離黃C (HC)、178、黃C′178 (HC′178)、178′黃C (178′HC)、PH6WC、PH4CV、PH6WC′PH4CV、PH4CV′PH6WC、昌7-2 (C)、鄭58 (Z)、昌7-2′鄭58 (C′Z)、鄭58′昌7-2 (Z′C)授粉后14 d的胚乳RNA反轉錄成cDNA, 用-imprinting對各自交系及正反交組合cDNA進行擴增, 擴增產物用I酶切。結果表明在所有雜交組合中, 來自母本的所有等位基因表現(xiàn)印記(圖5), 這與在B′M和M′B 14 d胚乳中的印記狀態(tài)是一致的。

圖2 ZmVIL1與擬南芥VIN3、VIL1蛋白序列比對

淡綠色和橙色方框內分別為保守的鋅指蛋白和纖連蛋白結構域。

The boxes colored with light green and orange respectively represent the conserved domains of zinc finger protein and fibronectin protein.

(圖3)

箭頭所示位置為B73和Mo17CDS在第1380、第1450和第1530堿基位置的單核苷酸多態(tài)性位點。

The arrows indicate the SNPs at the 1380th, 1450th, and 1530th base pairs inCDS of B73 and Mo17.

圖4 ZmVIL1在B73、Mo17正反交授粉后14 d胚乳及胚中的印記特性分析

A: 授粉后14 d胚乳中的印記特性分析; B: 授粉后14 d胚中的印記特性分析; Marker: D2000 plus。

A: imprinting characterization analysis ofin 14 DAP endosperm; B: imprinting characterization analysis ofin 14 DAP embryo. Marker: D2000 plus.

圖5 ZmVIL1在黃C和178、鄭58和昌7-2及PH4CV和PH6WC正交反授粉后14 d胚乳中印記特性分析

H: 黃C; C: 昌7-2; Z: 鄭58; 4C: PH4CV; 6W: PH6WC; Marker: D2000 plus。

H: Huang C; C: Chang 7-2; Z: Zheng 58; 4C: PH4CV; 6W: PH6WC; Marker: D2000 plus.

2.5 ZmVIL1在授粉后10~28 d B73′Mo17、Mo17′B73胚乳中印記特性分析

為了闡明在授粉后10~28 d胚乳中的印記情況, 我們又分離了B73′Mo17和Mo17′B73授粉后的10、12、16、18、20、22、24、26、28 d胚乳。同樣用特異性引物擴增胚乳cDNA, 用I對PCR產物酶切消化后進行電泳。結果顯示在B73′Mo17和Mo17′B73 12~28 d胚乳中, 來自母本等位基因完全沉默, 僅來自父本的等位基因表達, 因此母本等位基因在12~28 d胚乳中處于持續(xù)印記狀態(tài)(圖6)。

2.6 ZmVIL1的組織特性表達分析

轉錄組測序技術為研究基因的時空表達模式提供了極大的便利。利用Davidson等[28]、Li等[29]、Wang等[30]、Jia等[31]轉組錄測序結果中的表達豐度對該基因的時空表達特性進行分析。從基因的整體表達情況來看, 該基因在玉米生殖生長階段表達量較高, 其中在雌穗、花絲、雄穗和玉米授粉后10 d籽粒中表達量最高, 其次是在玉米胚珠、授粉后25 d的胚和胚乳中表達較高。在營養(yǎng)器官中, 根和頂端分生組織的表達量較高, 在玉米葉、葉舌和葉鞘中表達較低(圖7)。由此揭示不但在玉米籽粒發(fā)育中具有重要作用, 而且在玉米雄穗和雌穗的發(fā)育中也具有重要作用。

3 討論

玉米是我國第一大糧食作物, 玉米生產在我國糧食安全體系中具有重要作用。胚乳是玉米經濟性狀的重要表現(xiàn), 胚乳的發(fā)育對種子的大小具有顯著的影響[32]。胚乳發(fā)育分子生物學研究對于了解玉米籽粒發(fā)育的遺傳及調控具有重要意義。

圖6 ZmVIL1在B73、Mo17正反交授粉后10~28 d胚乳中印記特性分析

A:在B73′Mo17授粉后10~28 d胚乳中的印記特性分析; B:在Mo17′B73授粉后10~28 d胚乳中的印記特性分析; Marker: D2000 plus。

A: imprinting characterization analysis ofin 10–28 DAP endosperm of B73′Mo17; B: imprinting characterization analysis ofin 10–28 DAP endosperm of Mo17′B73; Marker: D2000 plus.

圖7 ZmVIL1在玉米不同組織中的表達

Root: 根; SAM (shoot apical meristem): 頂端分生組織; Leaf: 葉; Ligule: 葉舌; Sheath: 葉鞘; Immature ear: 雌穗; Immature tassel: 雄穗; Anther: 花藥; Pollen: 花粉; Silk: 花絲; Ovule: 胚珠; Seed_5 DAP: 授粉后5 d籽粒; Seed_10 DAP: 授粉后10 d籽粒; Embryo_25 DAP: 授粉后25 d胚; Endosperm_25 DAP: 授粉后25 d胚乳。

印記基因主要存在于開花植物胚乳中[33]。是一個印記基因[11], 我們利用RACE克隆了基因cDNA的全長, 預測編碼蛋白由598個氨基酸組成, 具有典型的鋅指蛋白和纖連蛋白保守結構域, 這與擬南芥VIN3、VIL1蛋白保守結構功能域是一致的, 由此可以推測ZmVIL1在功能上可能具有保守性。印記基因的表達具有親源效應[34], 其等位基因因親本來源的不同致使其表達呈現(xiàn)一定的差異, 不同的印記基因有不同的印記特性。例如,在胚和胚乳中均表現(xiàn)印記, 雖然在B′M和178′HC雜交組合中表現(xiàn)差異印記, 而在其他一些雜交組合表現(xiàn)二元印記, 但是在所有雜交組合中均表現(xiàn)為父本特異性印記[12]; 不同于,只在胚乳中印記, 并且在所有的雜交組合中均表現(xiàn)母本基因特異性的二元印記; 與相同的是, 其在授粉后12~28 d胚乳中表現(xiàn)持續(xù)印記。印記基因在種子發(fā)育過程中具有重要作用, Berger和Chaudhury[35]指出增加額外的父本基因組會使胚乳變大, 反之增加額外的母本基因組導致胚乳變小。Haig和Westoby[36]也認為印記基因在調控營養(yǎng)從母體到后代的轉運中具有重要作用; 父本印記基因傾向于抑制營養(yǎng)的分配, 而母本印記基因則促進營養(yǎng)的轉運。是第一個在植物中被發(fā)現(xiàn)的控制營養(yǎng)物質吸收及分配的印記基因。Costa等[13]研究表明玉米印記基因在籽粒發(fā)育過程中控制營養(yǎng)物質的分配與吸收, 在胚乳營養(yǎng)物質轉運及細胞分化過程中是必不可少的;基因被敲除后, 籽粒中果糖、葡萄糖含量顯著降低, 籽粒變小; 反之提高的表達量, 玉米籽粒則顯著增大。結合Davidson等[28]對籽粒轉錄組測序結果, 在授粉后10 d籽粒中表達量在所有組織中最高, 由此可推測可能在該時期的玉米籽粒發(fā)育中具有重要功能。

同時我們也注意到在玉米花序中也具有很高的表達水平。是擬南芥的同源基因。是基因家族中的一員[27,37], 這個基因家族成員還包括-。、和在擬南芥中是重要的促花基因;和共同通過組蛋白修飾抑制和基因的表達, 從而促進擬南芥開花[27,37]。在無光周期誘導條件下抑制同源基因從而促進開花[38]。此外, 在水稻中也鑒定出4個基因(-)[23]。功能的缺失導致無論在長日照或者短日照條件下水稻開花的延遲[39]。玉米是不需要經低溫春化的短日照作物, ZmVIL1與擬南芥、水稻同源基因編碼蛋白的分子系統(tǒng)進化分析顯示(圖8), ZmVIL1與水稻OsVIL3、OsVIL1和擬南芥VIL1聚為一個分支, 因此可以推測ZmVIL1在玉米花發(fā)育過程中也具有重要作用, 但由于在植物基因組長期的進化過程中, ZmVIL1與VIL1在功能上可能產生了分化。至于ZmVIL1在玉米花發(fā)育中是否具有重要作用及扮演何種角色需要進一步的研究。

圖8 ZmVIL1與擬南芥、水稻中VIN3蛋白家族分子進化關系分析

4 結論

玉米胚乳印記基因cDNA全長2201 bp, CDS長1797 bp, 預測編碼蛋白由598個氨基酸組成。在B73和Mo17正反交授粉后14 d的胚乳中來自母本的等位基因完全沉默, 而在胚中2個等位基因正常表達,是一個父本表達的二元胚乳印記基因。在B73和Mo17正反交授粉后12~28 d胚乳中母本等位基因處于持續(xù)印記狀態(tài)。在鄭58和昌7-2、黃C和178及PH6WC和PH4CV正反交授粉后14 d胚乳中, 均只有父本等位基因表達, 由此可知又是一個基因特異性的印記基因。在玉米籽粒、雄穗和雌穗中均有較高的表達量, 推測在玉米生殖生長過程中具有重要功能。

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Cloning and Imprinting Characterization Analyses of Paternally Expressed Genein Maize Endosperm

LIU Chao-Xian**, WANG Jiu-Guang**, MEI Xiu-Peng, YU Ting-Ting, WANG Guo-Qiang, ZHOU Lian, and CAI Yi-Lin*

Maize Research Institute, Southwest University / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400715, China

Imprint genes play important roles in maize seed development.is a paternal-preferentially expressed gene. In this study, the full length ofcDNA was cloned by RACE, which is about 2.2 kb and encodes a protein consisting of 598 amino acids. The analyses of allele expression ofin endosperm and embryo at 14 days after pollination (DAP) of hybrids from reciprocal crosses between B73 and Mo17 indicated thatwas maternally imprinted in endosperm, while not in embryo. The allele expression was extensively evaluated in 14 DAP endosperm of hybrids form reciprocal crosses of Zheng 58 and Chang 7-2, Huang C and 178, PH6WC and PH4CV, and in 10-28 DAP endosperm of hybrids form reciprocal crosses of B73 and Mo17, suggesting thatwas gene-specific and binary imprinting and consistently imprinted in endosperm from 12 to 28 DAP. Expression pattern analyses demonstratedwas constitutively expressed from vegetative to reproductive stages.was strongly expressed in seed at 10 DAP, immature tassels, immature ears and silk, and secondly expressed in ovule, embryo at 25 DAP and root, suggesting thatplays important roles in maize seed and flower development.

; gene cloning; gene imprinting; imprinting pattern

2017-07-11;

2017-11-21;

2017-12-04.

10.3724/SP.J.1006.2018.00376

本研究由中國博士后科學基金項目(2014M552303), 中央高校基本科研業(yè)務費(XDJK2015B009)和雜交玉米新品種“中科玉9699”和“西大白糯1號”的技術集成與示范項目(cstc2015jcsf-nycgzhA80006)資助。

This study was supported by China Postdoctoral Science Foundation (2014M552303), Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2015B009), and the Technology Integration and Demonstration of Zhongkeyu 9699, and Xidabainuo 1 (cstc2015jcsf-nycgzhA80006).

Corresponding author蔡一林, E-mail: caiyilin1789@163.com ** 同等貢獻(Contributed equally to this work)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171203.1645.004.html