梁云飛 張林成 蒲全明 雷鎮(zhèn)澤 施松梅 姜宇鵬 任雪松 高啟國(guó),*

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甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄因子的克隆與轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的表型分析

梁云飛1,**張林成1,**蒲全明2雷鎮(zhèn)澤1施松梅1姜宇鵬1任雪松1高啟國(guó)1,*

1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院 / 南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400716;2南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 四川南充 637000

bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)調(diào)控有重要作用, 為了研究基因在甘藍(lán)葉片發(fā)育及形態(tài)建成中的調(diào)控功能, 本文以甘藍(lán)品種519為材料, 克隆出轉(zhuǎn)錄因子基因。序列分析表明, 該基因含有一個(gè)795 bp的開放閱讀框, 編碼264個(gè)氨基酸, 具有一個(gè)保守的典型bHLH結(jié)構(gòu)域。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將正義基因?qū)敫仕{(lán)品種519中以增強(qiáng)表達(dá), 通過(guò)PCR篩選出9株T0代轉(zhuǎn)基因單株, 結(jié)合T2代單株的qRT-PCR分析表明, 篩選的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)基因的表達(dá)積累量明顯高于野生型。試驗(yàn)基地隔離網(wǎng)內(nèi)種植的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)表型明顯, 主要表現(xiàn)為蓮座期莖葉間距拉長(zhǎng)、葉柄伸長(zhǎng)以及植株莖和葉柄顯示紫色, 植株葉片平展, 無(wú)向上向內(nèi)卷曲趨勢(shì), 表明基因可能對(duì)甘藍(lán)葉片發(fā)育有重要的調(diào)控作用。

甘藍(lán); BoLH27; 基因克隆; 轉(zhuǎn)基因; 表型

bHLH (basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 1989年Ludwig等[1]首次從玉米中分離出bHLH類蛋白質(zhì)Lc (leaf colour), 證明該基因參與調(diào)控花青素合成。Ling等[2]在番茄中鑒定出bHLH類基因, 發(fā)現(xiàn)該基因調(diào)控番茄適應(yīng)缺鐵脅迫。Kiribuchi等[3]從水稻中分離出bHLH基因類, 發(fā)現(xiàn)該基因通過(guò)茉莉酸信號(hào)途徑響應(yīng)干旱脅迫。擬南芥基因組中經(jīng)測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)超過(guò)150個(gè)[4-5]。bHLH 結(jié)構(gòu)域約含50~60個(gè)氨基酸, 由堿性區(qū)域(basic region)和α螺旋1-環(huán)-α螺旋-2 (helix-loop-helix)組成, 其堿性區(qū)域通常能與基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-Box和G-Box結(jié)合[6-8], 一些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)通常保守, 13E-16R是結(jié)合下游基因啟動(dòng)子E-box的2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)[9], Leu23是bHLH功能域形成同源或異源二聚體的關(guān)鍵位點(diǎn)[10]。

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族具有重要的生物學(xué)功能, 參與植物一系列的生命活動(dòng), 涉及生長(zhǎng)發(fā)育[11-12]、代謝調(diào)控[13-14]以及對(duì)非生物脅迫的抗性等[15]。同樣, 具有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子在葉片發(fā)育和形態(tài)建成中也有重要調(diào)控作用。()是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 擬南芥中功能缺失的突變體具有較大的子葉, 較長(zhǎng)的下胚軸和較大的葉片, 而的過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致較小的子葉和葉片[16]。在擬南芥中利用啟動(dòng)子超表達(dá)表皮細(xì)胞中特異表達(dá)的(), 能使植株形成葉片卷曲的表型[17]。金魚草中發(fā)現(xiàn)一種突變體, 能編碼具有bHLH結(jié)構(gòu)域的TCP蛋白,突變體的葉片邊緣區(qū)域過(guò)度生長(zhǎng), 逐漸使原本平展的葉片變得卷曲[18]。擬南芥中下調(diào)表達(dá)、、、四個(gè)基因能導(dǎo)致葉片變皺[19]。在擬南芥中增強(qiáng)表達(dá)基因會(huì)使植株早熟, 細(xì)胞增殖減慢, 葉片變小[20]。在擬南芥中下調(diào)表達(dá)、、三個(gè)基因會(huì)造成葉片變大, 鄰近的葉片會(huì)擴(kuò)張到葉柄區(qū)域[21]。2013年莫曉婷[22]在玉米中克隆到轉(zhuǎn)錄因子, 在擬南芥中超表達(dá)時(shí)植株呈現(xiàn)出矮化, 葉片數(shù)量增加, 葉片長(zhǎng)寬比變大, 葉片及果莢皺縮。

本課題組前期利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)掘在甘藍(lán)519蓮座期和結(jié)球期差異表達(dá)的基因, 從中選出在結(jié)球期上調(diào)表達(dá)的基因。本試驗(yàn)克隆出基因的編碼序列, 進(jìn)行了序列生物信息學(xué)分析, 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)入甘藍(lán)519, 令其超量表達(dá), 并初步分析轉(zhuǎn)基因植株表型, 以期為進(jìn)一步探討基因在甘藍(lán)葉片發(fā)育及形態(tài)建成中的調(diào)控功能和作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與載體

中晚熟結(jié)球性好的純合穩(wěn)定品種甘藍(lán)519, 由西南大學(xué)十字花科研究所提供, 2013年9月將幼苗種于重慶歇馬試驗(yàn)基地, 2014年9月將T0代幼苗種植在試驗(yàn)基地, 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)開花后, 單株人工自花授粉留種, 2015年9月種植經(jīng)PCR鑒定的T1代9個(gè)株系, 每個(gè)株系30個(gè)單株, 2016年9月選取3∶1分離的T2代4個(gè)株系, 共種40株幼苗。2014年10月選取10株T0代8片葉的幼苗期葉片用于轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定, 2016年10月隨機(jī)取3株T2代8葉片幼苗期的葉片(每株3片)用于轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量表達(dá)鑒定。

克隆載體pEASY-Blunt Simple購(gòu)于北京全式金公司。根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株、載體pBL525和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

用植物總RNA提取試劑盒(天根, 北京)提取甘藍(lán)幼嫩莖尖總RNA, 通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性, 之后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA用于基因克隆, 熒光定量取材部位為幼苗期葉片, 方法同上。

1.3 基因的克隆及序列的生物信息學(xué)分析

利用蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/ index.php)和甘藍(lán)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ocri-genomics. org/bolbase/)查找同源序列, 結(jié)合前期課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的包含的片段, 對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù), 得知轉(zhuǎn)錄組獲得的片段包含完整的, 根據(jù)序列的保守性運(yùn)用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物, 采用高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase (寶生物工程(大連)有限公司)從cDNA中擴(kuò)增基因, 基因擴(kuò)增所用引物klBoLH27見表1。PCR程序?yàn)?8°C預(yù)變性1 min; 98°C變性20 s, 63°C退火15 s, 72°C延伸60 s, 35個(gè)循環(huán); 72°C延伸10 min。將目的片段與克隆載體pEASY連接(全式金生物技術(shù)有限公司, 北京), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 挑取陽(yáng)性單克隆委托成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

用EditSeq軟件推導(dǎo)基因編碼的氨基酸序列, 運(yùn)用ExPASy (http://expasy.org/tools/)分析氨基酸的基本理化性質(zhì), 用在線網(wǎng)站Swiss-model (http:// swissmodel.expasy.org/)、SMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)、PROSITE (http://www.expasy.org/ prosite)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域。在線預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)(http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)和信號(hào)肽(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/), 用在線網(wǎng)站W(wǎng)OLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析, MEGA6.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化

將酶切位點(diǎn)H I引入引物, 載體構(gòu)建所用引物pcBoLH27見表1。用帶有H I酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增, 采用高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase (寶生物工程(大連)有限公司)。PCR程序?yàn)?8°C預(yù)變性1 min; 98°C變性20 s, 62°C退火15 s, 72°C延伸60 s, 35個(gè)循環(huán); 72°C延伸10 min。將全長(zhǎng)用H I單酶切, 連接載體pBL525同時(shí)用H I單酶切, 把連接到載體pBL525上, 轉(zhuǎn)化DH5α后保存PCR檢測(cè)正向插入的菌液, 提取質(zhì)粒后用d III和R I雙酶切, 同樣用d III和R I雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1300, 連接后轉(zhuǎn)化DH5α, 雙酶切驗(yàn)證后送公司測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證, 將構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pC35S-。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化方法, 利用根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染甘藍(lán)下胚軸。組培所用培養(yǎng)基參考何紹敏等[23]并做了修改, 甘藍(lán)預(yù)培養(yǎng)基含MS+3 mg L–16-BA+0.25 mg L–1NAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂; 甘藍(lán)篩選培養(yǎng)基含MS+3 mg L–16-BA+0.25 mg L–1NAA+5 mg L–1PPT+500 mg L–1Carb+3%蔗糖+0.8%瓊脂; 甘藍(lán)生根培養(yǎng)基含MS+0.25 mg L–1NAA+5 mg L–1PPT+500 mg L–1Carb+3%蔗糖+0.8%瓊脂。篩選抗性植株在育苗室內(nèi)培養(yǎng)成活后轉(zhuǎn)入室外培養(yǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的PCR檢測(cè)及熒光定量PCR檢測(cè)

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)葉片總DNA。采用Master Mix (南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行PCR檢測(cè), 委托成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。取3株T2代8葉片幼苗期的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片(每株3片葉作為生物學(xué)重復(fù)) 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 參照SYBRPremix ExII (寶生物工程(大連)有限公司)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR, 配制20 μL反應(yīng)體系, 在熒光定量PCR儀CFX96 (Bio-Rad, 美國(guó))上進(jìn)行, 反應(yīng)體系為1.6 μL cDNA模板, 10 μL SYBR Premix, 0.8 μL正向引物, 0.8 μL反向引物(表1中的qBoLH27), 加ddH2O至總體積20 μL。定量PCR條件為95°C預(yù)變性30 s; 95°C變性5 s, 58°C退火30 s, 40個(gè)循環(huán)。以上反應(yīng)每個(gè)樣品的技術(shù)重復(fù)3組。采用非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)519作為參照比對(duì)超表達(dá)植株的基因表達(dá)情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的主莖葉間距的測(cè)量

隨機(jī)取T2代生長(zhǎng)健壯的3個(gè)株系每株系3株24片葉的蓮座期超表達(dá)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán), 從根部向上數(shù)第16片葉的葉柄處開始計(jì)數(shù), 向上連續(xù)測(cè)量5片葉的葉柄長(zhǎng)度, 測(cè)量這5片葉在主莖的葉柄著生點(diǎn)的間距, 并以同樣物候期的未轉(zhuǎn)化甘藍(lán)519為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoLH27基因的序列分析

以甘藍(lán)結(jié)球期莖尖cDNA為模板, PCR擴(kuò)增出約800 bp條帶。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該cDNA序列長(zhǎng)度為795 bp, 包含一個(gè)完整的編碼框, 將其命名為。推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1, 分子量為3.0 kDa, 理論等電點(diǎn)為4.82, 編碼264個(gè)氨基酸。不穩(wěn)定系數(shù)為57.47, 推測(cè)為不穩(wěn)定蛋白, 親水性為–0.583, 是親水性蛋白。其二級(jí)結(jié)構(gòu)由27.65%的α-螺旋、12.88%的β-折疊和59.47%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明BoLH27為非跨膜蛋白, SignalP信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示該蛋白不含信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其定位在細(xì)胞核。

表1 試驗(yàn)使用的引物

下畫線為酶切位點(diǎn)。Sequences underlined indicate enzyme restriction site.

圖1 甘藍(lán)BoLH27 cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列

黑色陰影示bHLH結(jié)構(gòu)域; 實(shí)線框示N-糖基化位點(diǎn); 虛線框示cAMP磷酸位點(diǎn); 下畫線示蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn); 波浪線示酪蛋白II磷酸化位點(diǎn); 橢圓框示N-豆蔻?；稽c(diǎn)。

The black shadow shows bHLH domain; the full line box shows N-glycosylation site; the dotted line box shows cAMP phosphorylation site; the underline shows cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site; the wavy line shows casein kinase II phosphorylation site; the oval box shows N-glycosylation site.

通過(guò)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn), BoLH27在50~99氨基酸處有一個(gè)典型bHLH結(jié)構(gòu)域, 多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), BoLH27所含的bHLH結(jié)構(gòu)域具有保守的氨基酸位點(diǎn)(圖2), 分別是13E-16R和Leu23, 13E-16R是結(jié)合下游基因啟動(dòng)子E-box的2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)[9], Leu23是bHLH功能域形成二聚體的關(guān)鍵位點(diǎn)[10]收集其他物種BoLH27的同源序列, 通過(guò)ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)后, 運(yùn)用Mega6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建, 從圖3可見BoLH27與白菜、蘿卜、遏藍(lán)菜bHLH27聚為一類; 醉蝶花、亞麻薺、白菜bHLH35聚為一類。與甘藍(lán)BoLH27親緣關(guān)系近的白菜、蘿卜、遏藍(lán)菜均為十字花科植物, 同科植物蛋白同源性較高, 基因很保守, 其中與白菜bHLH27親緣關(guān)系最近, 推測(cè)其蛋白質(zhì)有相似的功能。

圖2 BoLH27及其同源序列bHLH結(jié)構(gòu)域比對(duì)分析

星號(hào)表示bHLH結(jié)構(gòu)域保守的氨基酸位點(diǎn); 三角表示參與二聚體形成的位點(diǎn)。

Stars indicate the conserved amino acids of bHLH domain; triangle indicates amino acid involved in dimer formation.

圖3 BoLH27及其同源氨基酸序列進(jìn)化分析

2.2 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)

甘藍(lán)下胚軸在篩選培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)3~4周的培養(yǎng)后, 少量獲得抗性的下胚軸可以存活, 在切口脫分化形成愈傷組織, 將長(zhǎng)出不定芽的材料(圖4-A)多次轉(zhuǎn)到新鮮的篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng), 直至不定芽長(zhǎng)至3 cm時(shí), 切下不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng), 4~5周后長(zhǎng)出白色的根(圖4-B, C)。在育苗室內(nèi)煉苗4~7 d后轉(zhuǎn)入試驗(yàn)基地隔離網(wǎng)內(nèi)栽種(圖4-D)。

圖4 pC35S-BoLH27轉(zhuǎn)基因植株的獲得

A: 抗性芽的生長(zhǎng); B、C: 抗性苗生根; D: 抗性植株幼苗。

A: the growth of resistant bud; B, C: the rooting of resistant seedling; D: the seedling of transgenic cabbage.

通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法共獲得34株抗性植株, 在生長(zhǎng)到8片葉的幼苗期時(shí)隨機(jī)取10株植株, 以葉片為材料提取基因組DNA, 之后以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè), 以構(gòu)建成功的正義載體作為陽(yáng)性對(duì)照, 非轉(zhuǎn)基因519甘藍(lán)為陰性對(duì)照, 野生型中沒(méi)有下游檢測(cè)引物的序列, 所以擴(kuò)增不到產(chǎn)物。圖5表明, 10株抗性甘藍(lán)植株中的9株擴(kuò)增到了預(yù)期的約1000 bp的條帶, 只有10號(hào)和陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到, 把PCR產(chǎn)物送擎科公司測(cè)序, 結(jié)果顯示擴(kuò)增序列與和基因片段序列完全一致, 說(shuō)明植物表達(dá)載體已成功整合到轉(zhuǎn)基因植株1~9號(hào)中。隨后我們對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了熒光定量PCR檢測(cè), 從已經(jīng)鑒定的成功轉(zhuǎn)基因植株的T2代植株中隨機(jī)選取3株在8片葉的幼苗期葉片進(jìn)行熒光定量, 從圖6看出, 3株超表達(dá)植株的基因相對(duì)表達(dá)量均高于野生型, 最高為2.5倍, 平均為2.07倍。

2.3 T2代轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)表型分析

在10片葉幼苗期野生型甘藍(lán)519的葉片呈卵圓形, 葉柄較短, 葉柄及葉脈均為白色, 基本沒(méi)有葉耳(圖7-A: WT);超表達(dá)甘藍(lán)的葉片呈橢圓形, 但具有缺刻, 葉柄明顯拉長(zhǎng), 顯示輕微的紫色, 葉柄上著生的葉耳明顯, 葉耳多數(shù)左右對(duì)稱分布(圖7-A: BoLH27)。在24片葉蓮座期野生型甘藍(lán)519的葉片呈圓形, 葉片寬大, 葉柄急劇短縮, 幾乎無(wú)葉柄, 葉脈為白色, 無(wú)葉耳(圖7-C: WT); 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的葉片呈橢圓形, 相比野生型更狹長(zhǎng), 葉柄伸長(zhǎng), 葉柄平均長(zhǎng)15.5 cm (表2), 葉柄及葉脈明顯變紫, 葉柄基部有葉耳及贅生物,葉片平展(圖7-C: BoLH27);主莖呈紫色, 輪生葉在主莖著生點(diǎn)的間距比野生型明顯變大(圖7-B: BoLH27), 著生點(diǎn)的間距平均為1.7 cm (表2), 而野生型甘藍(lán)519緊湊, 幾乎沒(méi)有間距(圖7-B: WT)。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

M: DL2000; 1~10: 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán); +: 陽(yáng)性對(duì)照; –: 非轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。

M: DL2000; 1–10: transgenic cabbage; +: positive plamid; –: non-transgenic cabbage.

圖6 BoLH27在野生型和轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)中的表達(dá)分析

WT: 野生型株系; S13, S14, S33: 超表達(dá)株系。

WT: non-transgenic lines; S13, S14, S33: transgenic lines.

圖7 野生型株系和BoLH27超表達(dá)株系表型

A: 10片葉幼苗期; B: 24片葉蓮座期側(cè)視圖; C: 24片葉蓮座期俯視圖; WT: 野生型; BoLH27: 超表達(dá)株系; partial: 超表達(dá)株系局部放大。

A: seedling stage with ten leaves; B: side view of rosette stage with twenty-four leaves; C: top view of rosette stage with twenty-four leaves; WT: non-transgenic lines; BoLH27: overexpressed lines; partial: partial enlarged drawing of overexpressed lines.

表2 超表達(dá)株系平均葉柄長(zhǎng)度和平均葉間距

3 討論

截至目前有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的報(bào)道大多集中在擬南芥、玉米、水稻等模式作物上[7,24]。本研究克隆獲得了甘藍(lán)基因, 其蛋白包含典型的bHLH家族保守序列, 有堿性區(qū)域和α螺旋1-環(huán)-α螺旋-2, 與前人報(bào)道的一致[26-27], 功能域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)保守, 與前人報(bào)道的相同。包括結(jié)合下游基因啟動(dòng)子E-box的2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)13E-16R[9], bHLH功能域形成二聚體的關(guān)鍵位點(diǎn)Leu23[10]。在系統(tǒng)進(jìn)化中, 十字花科植物BoLH27較為保守。

研究表明, bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在葉片發(fā)育和形態(tài)調(diào)控方面具有重要作用。HLH蛋白ILI1和PRE1能與bHLH蛋白IBH1結(jié)合, 在水稻中超表達(dá)基因能使葉片豎直生長(zhǎng); 在擬南芥中超表達(dá)該基因?qū)е轮仓臧27]。和可能通過(guò)形成異源二聚體的方式使轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用失活,或者的超表達(dá)能增加細(xì)胞的長(zhǎng)度和抑制矮小的表型[27]。大豆隱花色素基因與bHLH類型轉(zhuǎn)錄因子在藍(lán)光下發(fā)生特異的相互作用, 在大豆中超表達(dá)基因使植株葉片早衰, 這種機(jī)制是由于能促進(jìn)衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[28]。酵母雙雜交證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子bHLH048可以與基因啟動(dòng)子區(qū)域相互作用[29], LOB蛋白在葉片近-遠(yuǎn)軸建立中起負(fù)調(diào)控作用, 超表達(dá)基因會(huì)使葉形變小, 子葉和葉片向上向內(nèi)彎曲[30]。TCP蛋白是一種具有bHLH結(jié)構(gòu)域的蛋白, TCP7/23可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)控葉片早期的發(fā)育, 酵母雙雜交證實(shí)TCP7和TCP23可以相互作用, 并可強(qiáng)增基因的表達(dá),基因在植物頂端分生組織的維持上有重要作用[31]。在擬南芥的超表達(dá)造成了葉柄和叢生葉的伸長(zhǎng),TCP1能和油菜素內(nèi)酯合成的關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子相互作用, 此外TCP1能正向調(diào)控的轉(zhuǎn)錄豐度[32]。在本研究中, 超表達(dá)的甘藍(lán)植株在幼苗期和蓮座期均觀察到了明顯的葉柄伸長(zhǎng), 這與在擬南芥中超表達(dá)基因造成葉柄伸長(zhǎng)的表型極為類似。在擬南芥中超表達(dá)會(huì)降低五個(gè)基因的表達(dá), 進(jìn)而使植株形成卷縮葉[33], 與之相似的是本研究獲得的基因超表達(dá)的甘藍(lán)植株,在蓮座期后期其本應(yīng)向上向內(nèi)卷曲的葉片繼續(xù)平展生長(zhǎng), 由此表明, 在甘藍(lán)中可能起到了類似與擬南芥中同為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能, 在葉片卷曲過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子還可以調(diào)節(jié)類黃酮生物合成, 而花青素是類黃酮中的一大類。玉米中的同源基因和參與紫色花青素合成的調(diào)節(jié)[34]。矮牽牛花中bHLH基因和能促進(jìn)花青素合成基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控花的著色[35]。是擬南芥中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控類黃酮合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,的轉(zhuǎn)錄豐度受PAP1蛋白的負(fù)調(diào)控[36]。擬南芥中bHLH成員和相繼被發(fā)現(xiàn), 在其雙突變體中花青素的合成受到抑制[37]。在楊梅中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子, 通過(guò)煙草葉片的異源瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)能與結(jié)合從而引起花青素合成的顯著增加, 用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的方法揭示了和能夠選擇性地激活五種特異的啟動(dòng)子(、、、、)[38]。在十字花科植物花椰菜中發(fā)現(xiàn)一種()突變體,編碼一種轉(zhuǎn)錄因子, 上調(diào)表達(dá)的能特異地激活bHLH轉(zhuǎn)錄因子和幾個(gè)花青素結(jié)構(gòu)基因, 能在凝乳組織和其他組織中合成大量的青花素,使突變體呈現(xiàn)顯著的紫色表型[39]。與上述報(bào)道的情況類似, 本研究中通過(guò)在甘藍(lán)519材料中超表達(dá)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因, 使轉(zhuǎn)基因植株的莖和葉脈呈現(xiàn)紫色(圖7-B: partial; 圖7-C: partial), 表明在甘藍(lán)中可能正向調(diào)控花青素的積累, 并在多序列比對(duì)中BoLH27和BobHLH1兩者均具有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域(圖2), 然而是該蛋白直接調(diào)控花青素積累相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá), 還是與其他轉(zhuǎn)錄因子一起共同參與調(diào)控等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從甘藍(lán)519材料中克隆了一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子BoLH27的編碼序列, 該蛋白具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域和完全保守的關(guān)鍵位點(diǎn)13E-16R和Leu23。獲得了超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株, 轉(zhuǎn)基因植物莖葉間距變大、葉柄伸長(zhǎng)、葉耳明顯、葉片平展生長(zhǎng), 且植株莖和葉脈呈現(xiàn)紫色, 推測(cè)可能在甘藍(lán)形態(tài)建成和花青素積累過(guò)程中有調(diào)控作用, 該研究對(duì)于進(jìn)一步研究植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能具有一定的科學(xué)意義。

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Cloning ofGene from Cabbage and Phenotype Analysis of Transgenic Cabbage

LIANG Yun-Fei1,**, ZHANG Lin-Cheng1,**, PU Quan-Ming2, LEI Zhen-Ze1, SHI Song-Mei1, JIANG Yu-Peng1, REN Xue-Song1, and GAO Qi-Guo1,*

1College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University / Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400716, China;2Institute of Vegetables, Nanchong Academy of Agricultural Sciences, Nanchong 637000, Sichuan, China

bHLH transcription factor plays an important role in plant growth, development and morphological control. In order to exploregene regulatory function for leaf development and morphologic formation, thegene was cloned from cabbage (L.) variety 519. Sequence analysis indicated that the length ofgene was 795 bp, which encoded 264 amino acids. The BoLH27 protein contained conservative structure domains of the bHLH family. The sensegene was transformed into cabbage variety 519 bymediated method, PCR analysis exhibited thatwas genetically transformed into nine individual plants, qRT-PCR analysis revealed thathad higher expression level in T2transgenic cabbage than in wild type. The phenotype at rosette stage of transgenic cabbage grown in the test base was obvious, showing elongated the stems and leaves, elongated petiole, purple stems and petiole, and flat leaves without upward inward curling trend. It suggested thatmay play important roles in the control of leaves development.

; BoLH27; gene cloning; transgene; phenotype

2017-06-06;

2017-11-21;

2017-12-11.

10.3724/SP.J.1006.2018.00397

本研究由國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)(2012CB113900)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900986)資助。

This study was supported by the National Program on Key Basic Research Project (973 program)(2012CB113900) and the National Natural Science Foundation of China (30900986).

Corresponding author高啟國(guó), E-mail: gaoqg031@swu.edu.cn **同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work).

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171211.0849.016.html