王 瑞 張秀艷 陳陽松 杜依聰 湯繼華 王國英 鄭 軍,*

?

一個新的玉米基因等位突變體的遺傳分析與分子鑒定

王 瑞1,2,**張秀艷3,**陳陽松2杜依聰2湯繼華1王國英2鄭 軍2,*

1河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 河南鄭州 450002;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;3中國農(nóng)業(yè)大學生物學院, 北京 100193

在玉米繁種過程中發(fā)現(xiàn)一個玉米穗發(fā)芽突變體(), 命名為。經(jīng)過連續(xù)多代自交發(fā)現(xiàn)該突變體性狀能穩(wěn)定遺傳, 并且表現(xiàn)為隱性單基因控制。以與自交系Mo17雜交構建F2遺傳定位群體, 利用BSR-Seq方法, 將目的基因定位于玉米第5染色體173.8~175.6 Mb之間。通過基因組序列信息分析發(fā)現(xiàn), 在此定位區(qū)間內(nèi)存在一個已報道的基因?；蚓幋a鉬喋呤合酶小亞基, 參與類胡蘿卜素裂解為ABA的過程。利用2個獨立的突變體和的雜合體, 分別與突變體雜合體做雜交進行等位測驗, 發(fā)現(xiàn)雜交后代中正常籽粒與穗發(fā)芽籽粒比例符合3∶1分離比?；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn)突變體中基因在第2外顯子末端及3￠非翻譯區(qū)有60個堿基的缺失, 與所報道的突變體、均在第2個外顯子有轉座子插入的突變方式不同。進一步通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),突變體中基因的表達量顯著降低。以上實驗證據(jù)表明,是一個新的基因等位突變體。

玉米; 穗發(fā)芽; 突變體;; 基因定位

作物種子穗發(fā)芽是指在收獲前籽粒在母體植株果穗上發(fā)芽的現(xiàn)象, 也稱為胚萌。穗發(fā)芽嚴重影響小麥、水稻等作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和種子質(zhì)量, 給作物生產(chǎn)帶來嚴重的經(jīng)濟損失, 因而穗發(fā)芽現(xiàn)象一直備受國內(nèi)外一些植物育種家和生理學家關注。20世紀50年代國際上就已經(jīng)開始研究穗發(fā)芽問題, 培育和篩選抗、耐穗發(fā)芽種質(zhì)資源, 發(fā)掘抗穗發(fā)芽的重要基因或QTL[1-3], 并采取各種措施解決生產(chǎn)上的穗發(fā)芽問題。

在玉米中, 主要通過穗發(fā)芽突變體()較深入研究穗發(fā)芽相關基因。從目前已報道的玉米穗發(fā)芽基因功能來看, 玉米穗發(fā)芽突變體主要通過阻斷ABA的生物合成或降低對ABA的感應度而使籽粒在母體果穗上提前萌發(fā)[4-5], 大致可將這些突變體分為兩大類。第一類是ABA缺陷型, 即ABA合成受阻。這類突變體中目前研究比較清楚的有、、、、、、、、、、等[6-13], 它們不能正常合成ABA, 導致玉米籽粒中ABA含量較低, 不能抑制種子萌發(fā), 從而表現(xiàn)穗發(fā)芽。例如, 玉米和突變體通過阻斷類胡蘿卜素生物合成途徑酶的合成進而影響ABA的合成[6-7];突變體抑制萜類物質(zhì)生物合成途徑中酶的合成,從而影響ABA的合成[10];突變體中ABA生物合成途徑的第一個關鍵步驟被阻斷, 即環(huán)氧類胡蘿卜素裂解為黃質(zhì)醛的過程被阻斷, 導致ABA生物合成受阻[9];突變體中鉬輔因子合成受阻, 使得ABA醛無法氧化成ABA[9]。第二類是ABA鈍感型。這類突變體目前研究較清楚的有、等[14], 此類突變體不影響ABA的生物合成或ABA的新陳代謝, 只是改變對ABA的響應, 因此, 具有穗發(fā)芽特性但不影響胚乳發(fā)育及幼苗顏色, 且外源ABA不能抑制種子萌發(fā)。例如, 玉米突變體內(nèi)源ABA含量并不低, 只是對外源ABA敏感性降低, 進而無法將ABA信號向下游傳遞[15]。

是玉米穗發(fā)芽突變體, 不能正常編碼植物鉬喋呤(MPT)合酶小亞基, 此酶調(diào)控鉬輔因子(MoCo)生物合成[16-19], 而MoCo是參與ABA前體——類胡蘿卜素裂解為ABA過程中的酶所必需的輔因子[12]。MoCo廣泛存在于原核生物和真核生物中, 而且也是多種酶的輔因子[20]。在植物中, 至少以下4類酶需要鉬輔因子才能維持活性, 即乙醛氧化酶、黃嘌呤脫氫酶、硝酸還原酶和亞硫酸氧化酶[20], 突變體就是缺少依賴鉬輔因子的乙醛氧化酶、黃嘌呤脫氫酶和亞硫酸氧化酶, 導致不能正常合成ABA, 使籽粒在母體上提前萌發(fā)[12]。因此,突變體是研究MPT合成酶小亞基功能的重要材料。

本研究對實驗室新發(fā)現(xiàn)的一個玉米穗發(fā)芽突變體進行了遺傳分析和基因定位, 最終發(fā)現(xiàn)是一個新的基因等位突變體。該研究為進一步深入解析玉米穗發(fā)芽的分子機制和基因功能提供了豐富的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米穗發(fā)芽突變體()在授粉后30 d左右, 便可在果穗上觀察到明顯的穗發(fā)芽表型?；蚨ㄎ蝗后w為雜合體與自交系Mo17雜交并自交獲得的F2群體。2個基因突變體505G ()、505I ()訂購自Maize Genetics Cooperation Stock Center (玉米遺傳學合作庫存中心, https://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/request)。

1.2 突變體的表型鑒定和遺傳分析

由于穗發(fā)芽的籽粒在果穗收獲時, 萌發(fā)的胚芽已干枯致死, 因此隨機選取穗發(fā)芽果穗上的正常籽粒種植, 自交后鑒定有穗發(fā)芽分離的果穗, 然后再取正常籽粒種植, 以此連續(xù)多代自交觀察該突變體表型。對于突變體表型的遺傳分析, 就在每一世代自交授粉后30 d左右, 剝開苞葉檢查穗發(fā)芽情況, 選取穗發(fā)芽果穗, 脫粒統(tǒng)計正常籽粒與穗發(fā)芽籽粒的分離比。

1.3 目的基因的初定位

采用BSR-Seq方法[21]對目的基因進行初定位。隨機選取有穗發(fā)芽表型分離的F2果穗, 各取40粒正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒, 分別剝?nèi)シN皮, 混池為2份實驗樣品, 液氮研磨, 利用植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司, Cat# DP432)提取籽?？俁NA, 在北京貝瑞和康生物技術有限公司利用HiSeq2000儀器完成轉錄組測序。參考BSR-Seq方法分析流程[21], 對2個樣本的測序結果進行分析, 提取2個樣本間大量的分子標記, 計算等位基因在2個混合池的分布比例, 分析后得出基因的初定位區(qū)間。

1.4 定位區(qū)間基因檢索及等位測驗

根據(jù)基因的初定位區(qū)間, 在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上(http://www.maizegdb.org/)檢索區(qū)間內(nèi)的基因注釋信息, 發(fā)現(xiàn)已經(jīng)報道的玉米穗發(fā)芽基因位于該區(qū)間內(nèi)[12]。

為檢測和是否等位, 分別從、、的雜合體后代中隨機挑選正常籽粒種植, 種植3行,和各2行, 每行25株。開花授粉時, 任選中一行進行單株自交, 同時收集這一行單株的花粉進行混粉, 分別授粉雜交和的其中一行每一個單株。同理,和的另外一行每個單株自交, 同時分別收集各行的花粉, 混粉分別雜交的另外2行每個單株。授粉后30 d, 剝開苞葉, 檢查是否有穗發(fā)芽的果穗。

1.5 基因組DNA提取、PCR擴增和序列分析

授粉后30 d左右, 分別取突變體、、正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒, 用CTAB法提取玉米基因組DNA[22]。根據(jù)基因組序列, 利用Primer3軟件(http://primer3.ut.ee/)在線設計7對引物(VP15-G-F1/R1~VP15-G-F7/R7) (表1), 擴增產(chǎn)物覆蓋基因組序列。以3個突變體(、、)基因組DNA為模板, 分別擴增基因片段, 將PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。使用DNAMAN軟件比對分析測序結果, 確定基因突變情況。PCR擴增體系為2 × KOD buffer 25 μL, 引物(10 μmol L–1) 0.75 μL, 模板DNA 2 μL, dNTPs (2.5 μmol L–1) 5 μL, KOD FX酶(1.0 U μL–1) 1 μL, 補超純水至50 μL。PCR擴增條件為94°C預變性5 min; 94°C變性10 s, 59°C退火30 s, 68°C延伸1 min, 35個循環(huán); 68°C延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.6 vp-like4和vp15再次等位測驗

根據(jù)測序結果, 針對、、分別用特異引物(VP15-G-F2/R2、VP15-G-F3/R3)準確鑒定其雜合突變體, 并再次進行等位測驗。取雜合突變體花粉分別雜交、雜合突變體植株; 同樣, 分別取、雜合突變體花粉雜交雜合突變體植株。授粉后30 d, 剝開苞葉, 檢查果穗上穗發(fā)芽籽粒情況, 并統(tǒng)計分離比。

1.7 RNA的提取及基因表達量分析

將授粉后30 d左右的穗發(fā)芽和正常籽粒, 剝?nèi)シN皮, 用植物總RNA提取試劑盒(同上)提取籽粒RNA。利用反轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司, Cat# AU311-02)反轉錄為cDNA, 以cDNA為模板, 設計特異引物VP15-CDS-F1/R1, 并以GAPDH為內(nèi)參引物(表1), 在ABI 7300實時定量PCR儀上進行實時定量分析。PCR體系為dye I 0.4 μL, 10′qMix 10 μL, 引物(10 μmol L–1) 0.5 μL, 模板cDNA 1 μL, 補超純水至20 μL。PCR擴增條件為95°C預變性2 min, 95°C變性10 s, 60°C退火15 s, 72°C延伸30 s, 循環(huán)數(shù)為40, 在72°C延伸30 s收集熒光, 并添加熔解曲線, 按公式2–DDCt計算出正常和穗發(fā)芽籽粒中基因表達量差異。

2 結果與分析

2.1 突變體vp-like4的表型和遺傳分析

情況下, 玉米授粉后30~40 d, 籽粒頂部的胚乳組織開始硬化, 標志著籽粒開始成熟, 授粉后60 d左右籽粒達到完全成熟。但是, 穗發(fā)芽突變體的雜合體在自交授粉后30 d左右, 就在果穗上明顯觀察到有穗發(fā)芽籽粒的分離(圖1-A)。由于穗發(fā)芽的籽粒在果穗收獲后, 萌發(fā)的胚芽已干枯致死(圖1-B, C), 因此將同一果穗上的正常籽粒再種植、自交, 觀察穗發(fā)芽的遺傳穩(wěn)定性和分離比例。經(jīng)過連續(xù)自交, 發(fā)現(xiàn)的突變性狀能穩(wěn)定遺傳。如表2所示, 隨機選有穗發(fā)芽分離的果穗, 統(tǒng)計正常與穗發(fā)芽籽粒, 經(jīng)卡方檢驗其分離比符合3∶1, 表明突變體的穗發(fā)芽性狀受單個隱性核基因控制。

表1 本研究所用的引物

圖1 vp-like4突變體穗發(fā)芽表型

Fig. 1 Viviparousphenotype ofmutant

A:雜合突變體授粉后30 d果穗上正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒; B:雜合突變體授粉后60 d果穗上正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒; C: 成熟的正常籽粒(WT)和穗發(fā)芽籽粒()。標尺=1 cm。

A: normal and viviparous kernels on aheterozygous ear at 30 days after self-pollination; B: normal and viviparous kernels on aheterozygous ear at 60 days after self-pollination; C: mature normal (WT) and viviparous kernels (). Bar = 1 cm.

表2 vp-like4雜合突變體自交授粉后正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒的分離情況

χ2(0.05)(1)=3.84.

2.2 vp-like4基因定位

BSR-Seq基因定位分析表明[21], 在第5染色體上有一個明顯的峰, 以> 0.5為標準, 將定位在玉米第5染色體173.8~175.6 Mb區(qū)間內(nèi)(圖2)。

2.3 vp-like4和vp15等位測驗

以混粉雜交和的兩行中, 有穗發(fā)芽分離的果穗(圖3-A, B); 同時,和分別混粉雜交的兩行中, 也有穗發(fā)芽的果穗(圖3-C, D)。這一結果初步說明,突變體很可能就是基因等位突變體。

圖2 利用BSR-Seq方法對vp-like4突變體基因的初定位

2.4 vp-like4突變位點鑒定

一步驗證和是等位基因并確認的突變位點, 以基因組序列為參考, 共設計7 對PCR引物(表1), 分別擴增、和基因組DNA, 擴增產(chǎn)物從-310 bp到4962 bp瓦片式覆蓋了基因組序列。對擴增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn),突變體中基因第2外顯子末端及3￠非翻譯區(qū)有60 bp堿基缺失; 而、是在第2個外顯子不同位置有轉座子插入(圖4)。由此說明突變體與的基因突變方式不同,是一個新的等位突變基因。

圖3 利用雜合突變體對vp-like4和vp15進行等位測驗

A, B: 以雜合突變體混粉分別雜交(A)和(B)的果穗上有穗發(fā)芽籽粒。C, D: 以(C)、(D)分別混粉雜交的果穗上有穗發(fā)芽籽粒。

A, B: viviparous kernels were respectively emerged on(A) and(B) heterozygous ear crossed by the mixed pollen ofheterozygous plants; C, D: viviparous kernels were emerged onheterozygous ear crossed by the mixed pollens of(C) and(D) heterozygous plants.

根據(jù)測序結果, 利用特異引物準確鑒定、、雜合突變體, 利用雜合突變體再一次進行等位測驗(具體操作見材料與方法部分)。授粉后30 d, 剝開苞葉檢測穗發(fā)芽情況發(fā)現(xiàn), 無論是花粉雜交、, 還是、花粉雜交果穗, 都出現(xiàn)了穗發(fā)芽籽粒的分離, 且統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)正常籽粒與穗發(fā)芽籽粒符合3∶1分離比(表3)。進一步證明突變體是基因等位突變體。

2.5 Vp15基因在突變體vp-like4中的表達

分別取、、雜合突變體果穗上的正常籽粒和穗發(fā)芽籽粒, 利用實時定量熒光PCR, 以GAPDH為內(nèi)參檢測基因的表達量(表1)。結果如圖5所示, 無論是在還是在和中, 穗發(fā)芽籽粒基因的表達量都顯著低于正常籽粒, 表明中堿基的缺失, 或者和中轉座子的插入, 都影響了基因正常表達。

圖4 Vp15基因結構示意圖及3個突變體的突變位置

表3 vp-like4與vp15突變體等位測驗

χ2(0.05)(1)=3.84.

圖5 實時定量PCR檢測Vp15基因分別在3個突變體vp-like4、vp15-umu1、vp15-DR1126中的正常(WT)和穗發(fā)芽(vp)籽粒中的表達量

3 討論

近年來, 高通量測序技術的迅速發(fā)展也促進了基因定位技術的發(fā)展。例如BSR-Seq (Bulked Segregant RNA-seq)技術是混合分離分析(BSA, Bulked Segregant Analysis)技術和RNA測序(RNA-Seq)技術結合發(fā)展起來的高效定位基因的新方法。利用BSR-Seq技術, 選擇分離群體中具有極端性狀的個體分別構建2個混樣池, 提取2個樣本總RNA進行轉錄組測序。分析RNA-Seq數(shù)據(jù)提取大量的分子標記, 對這些分子標記進行等位基因定量分析, 根據(jù)等位基因在不同混合池的分布比例, 定位目標基因。同時, 也可以利用RNA-Seq數(shù)據(jù)進行候選基因的預測[21]。對于像玉米這種基因組較為復雜的物種, BSR-Seq方法更為有效, 因為BSR-Seq只對mRNA測序, 不涉及重復序列和無用序列, 既減少了測序成本, 也提高了效率[23]。本研究鑒定到一個新的穗發(fā)芽突變體, 受單隱性核基因控制。我們使用BSR-Seq方法對突變體開展基因定位, 并迅速獲得定位區(qū)間。該技術的使用大大減少了工作量, 縮短了實驗周期, 為玉米突變體基因的定位帶來極大的方便。

眾所周知, 等位測驗是通過雜交實驗對雜交后代性狀的分離情況進行分析, 以確定基因的等位性及其遺傳距離。一般情況下, 等位測驗往往利用兩個隱性純合突變體進行雜交[24-25]。在本研究中, 由于穗發(fā)芽純合突變體提前發(fā)芽而導致胚芽在收獲時死亡, 另外, 由于在未克隆基因之前, 無法準確鑒定其為雜合突變體還是純合野生型, 因此, 本研究利用混粉的方法進行初步的等位性檢測。取花粉混粉的同時也對取粉行中的單株進行自交, 根據(jù)自交后檢測穗發(fā)芽的情況以確證所取花粉包含突變體花粉。反之, 接受花粉的植株除了接受花粉雜交授粉, 也同時保留另一行自交, 并根據(jù)自交后檢測穗發(fā)芽的情況以確證接受花粉單株包含突變體雌穗。本研究采取這樣的方法, 初步驗證了與的等位性。而隨后的基因序列驗證和準確的雜合體等位雜交, 也證明了確實是的等位基因。

已有研究報道顯示基因編碼MPT合成酶小亞基, 此酶調(diào)控鉬輔因子(MoCo)的合成[12], MPT合成酶小亞基廣泛存在于真核和原核生物中[26], 在人類中其功能缺失引起多種疾病[27-29]。MPT合成酶小亞基的C端有高度保守的結構域, 且C端的甘氨酸在催化反應中作為硫離子共價受體起著至關重要的作用[30]。本研究中在第2外顯子末端及3￠非翻譯區(qū)缺失60 bp堿基, 破壞VP15蛋白C端保守結構域, 進而使其無法正常調(diào)控MoCo合成, 導致不能正常合成ABA, 表現(xiàn)為突變體籽粒在母體上提前萌發(fā)。因此,突變體中基因的突變, 與所報道的、突變體分別在第2個外顯子有轉座子插入的突變方式不同, 是一個新的未見報道的基因等位突變方式。此外,突變體中基因60個堿基的缺失, 推測其蛋白序列發(fā)生移碼突變。我們檢測到突變體中基因mRNA的表達量顯著降低, 推測可能是由于形成了錯誤的mRNA從而導致其mRNA穩(wěn)定性差?？傊? 該突變體的鑒定和基因克隆, 為進一步深入研究玉米基因功能提供了新的實驗材料。

4 結論

新發(fā)現(xiàn)一個玉米穗發(fā)芽突變體, 該突變體受隱性單基因控制。通過BSR-Seq基因定位和基因克隆發(fā)現(xiàn),中基因在第2外顯子末端及3￠非翻譯區(qū)有60 bp堿基缺失的突變, 是一個新的基因等位突變體。功能突變基因的確認, 為探討玉米穗發(fā)芽的分子機制提供了新的試材。

[1] Mares D, Mrva K, Cheong J, Williams K, Watson B, Storlie E, Zou Y. A QTL located on chromosome 4A associated with dormancy in white-and red-grained wheats of diverse origin., 2005, 111: 1357–1364

[2] Lohwasser U, R?der M S, B?rner A. QTL mapping of the domestication traits pre-harvest sprouting and dormancy in wheat (L.)., 2005, 143: 247–249

[3] Yang Y, Zhao X L, Xia L Q, Chen X M, Xia, X C, Yu Z, R?der M. Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats., 2007, 115: 971–980

[4] Fang J, Chai C, Qian Q, Li C, Tang J, Sun L, Huang Z J, Zhang Y, Chu C. Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting and photo-oxidation in rice., 2008, 54: 177–189

[5] Gubler F, Millar A A, Jacobsen J V. Dormancy release, ABA and pre-harvest sprouting., 2005, 8: 183–187

[6] Hable W E, Oishi K K, Schumaker K S.encodes phytoenedesaturase, an enzyme essential for abscisic acid (ABA) accumulation and seed development in maize., 1998, 257: 167–176

[7] Singh M, Lewis P E, Hardeman K, Bai L, Rose J K, Mazourek M, Brutnell T P. Activator mutagenesis of thelocus of maize., 2003, 15: 874–884

[8] Suzuki M, Latshaw S, Sato Y, Settles A M, Koch K E, Hannah L C, McCarty D R. The maizelocus, encoding a putative-like peptidase, regulates abscisic acid accumulation and coordinates embryo and endosperm development., 2008, 146: 1193–1206

[9] Porch T G, Tseung C W, Schmelz E A, Mark Settles, A. The maizelocus encodes thegene required for molybdenum cofactor biosynthesis., 2006, 45: 250–263

[10] Maluf M P, Saab I N, Wurtzel E T, Mark Settles A. Themaize mutant is deficient in abscisic acid, carotenoids, and chlorophyll synthesis., 1997, 48: 1259–1268

[11] Schwartz S H, Tan B C, Gage D A, Zeevaart J A, McCarty D R. Specific oxidative cleavage of carotenoids byof maize., 1997, 276: 1872–1874

[12] Suzuki M, Mark Settles A, Tseung C W, Li Q B, Latshaw S, Wu S, McCarty D R. The maizelocus encodes the molybdopterin synthase small subunit., 2006, 45: 264–274

[13] Li F, Murillo C, Wurtzel E T. Maize Y9 encodes a product essential for 15-cis-ζ-carotene isomerization., 2007, 144: 1181–1189

[14] Suzuki M, Kao C Y, Cocciolone S, McCarty D R. Maizecomplementsand confers a novel ABA/auxin interaction in roots., 2001, 28: 409–418

[15] Christmann A, Moes D, Himmelbach A, Yang Y, Tang Y, Grill E. Integration of abscisic acid signalling into plant responses., 2006, 8: 314–325

[16] Sagi M, Fluhr R, Lips S H. Aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in aflacca tomato mutant with deficient abscisic acid and wilty phenotype., 1999, 120: 571–578

[17] Schwartz S H, Leon-Kloosterziel K M, Koornneef M, Zeevaart J A. Biochemical characterization of theandmutants in., 1997, 114: 161–166

[18] Bittner F, Oreb M, Mendel R R. ABA3 is a molybdenum cofactor sulfurase required for activation of aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in., 2001, 276: 40381–40384

[19] Xiong L, Ishitani M, Lee H, Zhu J K. Thelocus encodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stress- and osmotic stress-responsive gene expression., 2001, 13: 2063–2083

[20] Mendel R R, H?nsch R. Molybdoenzymes and molybdenum cofactor in plants., 2002, 53: 1689–1698

[21] Liu S, Yeh C T, Tang H M, Nettleton D, Schnable P S. Gene mapping via bulked segregant RNA-Seq (BSR-Seq)., 2012, 7: e36406

[22] 王關林, 方宏筠. 植物基因工程(第2版). 北京: 科學出版社, 2002. pp 742–744Wang G L, Fang H J. Plant Genetic Engineering, 2nd edn. Beijing: Science Press, 2002. pp 742–744 (in Chinese)

[23] Schneeberger K, Ossowski S, Lanz C, Juul T, Petersen A H, Nielsen K L, Andersen S U. SHOREmap: simultaneous mapping and mutation identification by deep sequencing., 2009, 6: 550–551

[24] 楊守萍, 蓋鈞鎰, 邱家馴. 大豆雄性不育突變體 NJ89-1核雄性不育基因的等位性測驗. 作物學報, 2003, 29: 372–378 Yang S P, Gai J Y, Qiu J X. Allelism tests of the male sterile gene of the mutant NJ89-1 in soybeans., 2003, 29: 372–378 (in Chinese with English abstract)

[25] Lyu H K, Zheng J, Wang T Y, Fu J, Huai J, Min H W, Wang G Y. The maize, a novel allele of, is required for maize internode elongation., 2014, 84: 243–257

[26] Rudolph M J, Wuebbens M M, Turque O, Rajagopalan K V, Schindelin H. Structural studies of molybdopterin synthase provide insights into its catalytic mechanism., 2003, 278: 14514–14522

[27] Rudolph M J, Johnson J L, Rajagopalan K V, Kisker C. The 1.2 ? structure of the human sulfite oxidase cytochrome b5 domain., 2003, 59: 1183–1191

[28] Stallmeyer B, Drugeon G, Reiss J, Haenni A L, Mendel R R. Human molybdopterin synthase gene: identification of a bicistronic transcript with overlapping reading frames., 1999, 64: 698–705

[29] Leimkühler S, Freuer A, Araujo J A S, Rajagopalan K V, Mendel R R. Mechanistic studies of human molybdopterin synthase reaction and characterization of mutants identified in group B patients of molybdenum cofactor deficiency., 2003, 278: 26127–26134

[30] Rudolph M J, Wuebbens M M, Rajagopalan K V, Schindelin H. Crystal structure of molybdopterin synthase and its evolutionary relationship to ubiquitin activation., 2001, 8: 42

Genetic Analysis and Molecular Characterization of a New Allelic Mutant ofGene in Maize

WANG Rui1,2,**, ZHANG Xiu-Yan3,**, CHEN Yang-Song2, DU Yi-Cong2, TANG Ji-Hua1, WANG Guo-Ying2, and ZHENG Jun2,*

1College of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3School of Life Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China

We identified a new maize viviparous mutant during seed reproduction, designated as.This mutant phenotype was steadily inherited and genetically regulated by a single recessive gene. Using an F2segregation population derived fromand inbred line Mo17, we mapped the target gene in an interval from 173.8 to 175.6 Mb on chromosome 5 by the BSR-Seq strategy. Using genomic sequence database, we found that viviparous geneis located in this mapping region. The maizegene encodes the molybdopterin synthase small subunit, which is required in the process of catalyzing the reaction from carotenoid to ABA. The heterozygous plants from two independentmutants,and, were used to cross withheterozygous plants, showing a 3:1 segregation ratio for normal and viviparous kernels. The genomic sequence analysis revealed thatmutant had a 60-bp deletion in the second exon and 3’-untranslated region ofgene, which is different fromandboth mutated from atransponson inserting in the second exon ofgene. Further RT-PCR analysis revealed that the expression level ofwas significantly lower in. Taken together, these evidences suggest thatis a new allele mutant from.

maize;; mutant;; gene mapping

2017-08-07;

2017-11-21;

2017-12-18.

10.3724/SP.J.1006.2018.00369

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0101002)和中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程專項經(jīng)費資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101002) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences.

Corresponding author鄭軍, E-mail: zhengjun02@caas.cn ** 同等貢獻(Contributed equally to this work)

王瑞, E-mail: 18612261636@163.com; 張秀艷, E-mail: xyzhang0818@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171218.0919.006.html