王芳權 楊 杰,* 范方軍 李文奇 王 軍 許 揚朱金燕 費云燕 仲維功

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水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因功能標記的開發(fā)與應用

王芳權1,2楊 杰1,2,*范方軍1,2李文奇1,2王 軍1,2許 揚1,2朱金燕1,2費云燕1仲維功1,2

1江蘇省農業(yè)科學院糧食作物研究所 / 國家水稻改良中心南京分中心 / 江蘇省優(yōu)質水稻工程技術研究中心, 江蘇南京 210014;2揚州大學 / 江蘇省糧食作物現代產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚州 225009

選育和利用抗除草劑水稻品種具有重要的生產實踐意義。通過篩選水稻資源, 發(fā)現了抗除草劑材料金粳818, 其基因編碼區(qū)第1880位堿基存在一個由G到A的堿基變異, 導致絲氨酸突變?yōu)樘於０? 從而具有除草劑抗性。本研究基于該位點的堿基變異, 設計了11條等位基因特異PCR (allelic-specific PCR, AS-PCR)引物, 經過優(yōu)化篩選, 獲得兩個引物組合F1N (S1/S9)和F1M (S1/S10), 將該標記命名為AS-ALS。利用F2群體及其親本和雜交種, 結合AS-ALS標記檢測和除草劑抗性分析, 結果表明感除草劑等位基因型只能被F1N引物對有效擴增, 抗除草劑等位基因型只能被F1M引物對有效擴增, 而雜合基因型能同時被兩對引物F1N和F1M擴增,純合或雜合等位基因型都表現抗除草劑,純合基因型表現感除草劑。因此本研究開發(fā)的標記能有效區(qū)分除草劑抗性基因的3種基因型, 基因型與表型完全對應。該標記用于回交育種, 可以選擇雜合基因型單株, 剔除純合等位基因型, 在自交的F2保留純合基因型單株, 連續(xù)自交, 能快速獲得除草劑抗性穩(wěn)定的水稻材料。該除草劑抗性基因的功能標記還可用于咪唑啉酮類除草劑抗性資源篩選。

水稻; 除草劑; 乙酰乳酸合成酶;基因; 功能標記

水稻是全世界近一半人口的主糧, 也是我國主要的糧食作物之一[1]。近年來, 隨著我國新型城鎮(zhèn)化和現代農業(yè)的發(fā)展, 水稻生產正在向集約化、規(guī)?；?、機械化發(fā)展, 機插秧、直播等輕簡栽培已成為發(fā)展趨勢[2]。然而, 直播稻田容易滋生雜草及雜草稻, 嚴重影響水稻生長、產量及稻谷品質。人工除草的成本極高, 制約了水稻生產朝著高產、高效、低成本方向發(fā)展, 不利于發(fā)展現代農業(yè)。噴施除草劑是防治雜草危害的有效手段。

咪唑啉酮類除草劑是由美國氰胺公司開發(fā)的一類高效廣譜低毒的除草劑, 目前已經有6種商品化產品, 包括咪唑煙酸、咪唑乙煙酸、咪草酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草煙和甲基咪草煙。咪唑乙煙酸, 又稱咪草煙, 是一種常用于大豆田的高效除草劑, 能有效防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草[3]。咪草煙的作用機理是通過抑制乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS)的活性, 從而抑制側鏈氨基酸的合成[4]。而作物對咪唑啉酮類除草劑的抗性則來自基因一個或多個氨基酸變異而導致酶的結構變化[5-7]。已報道的基因抗除草劑位點包括Gly95、Ala96、Ala122、Pro197、Asp376、Trp548、Ser627、Ser653和Gly654, 不同位點突變產生了抗除草劑水平的差異[7-10]。開展抗除草劑水稻育種與應用研究對于水稻輕簡栽培、提升農業(yè)生產效益具有重要的理論和實踐意義。

在先前的研究中, 我們從水稻品種資源材料中篩選到一個抗咪草煙的水稻材料金粳818。通過對金粳818基因的測序分析發(fā)現, 其基因存在第1880位堿基G轉換為A的突變, 即第627位氨基酸由絲氨酸(Ser, S)突變?yōu)樘於０?Asn, N)。該突變與報道的抗除草劑紅米稻strawhullR基因功能突變位點相同[10]。

該基因可以通過回交轉育到栽培品種中, 但傳統(tǒng)上需要進行噴施除草劑逐代篩選鑒定, 其過程經歷多代的雜交和回交, 育種周期長, 而且該基因為顯性基因, 表型選擇難以剔除雜合基因型, 更加大了育種周期和難度。因此, 利用分子標記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)技術, 篩選鑒定基因型, 加快雜交后代抗性性狀的早代穩(wěn)定, 對于抗除草劑基因快速轉育, 加快育種進程具有重要意義。本研究根據基因第1880位點的變異, 設計了等位基因特異PCR標記, 能夠有效選擇抗除草劑基因型, 加快水稻材料的抗性穩(wěn)定進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗除草劑水稻材料金粳818由本研究團隊從7000多份水稻品種資源材料中篩選獲得。金粳818由天津市水稻研究所利用津稻9618和津稻1007雜交經多年系譜法選育而成, 推測其抗性可能是在有殘留除草劑的大豆田中產生。金粳818、日本晴、南粳40、南粳41、南粳44、南粳45、南粳46、南粳49、南粳9108、南粳5055、淮稻5號、蘇秀867、武運粳21、武運粳24、武運粳27、徐稻3號、徐稻8號、鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻99、連粳7號、常農粳7號為粳稻品種; 9311、IR36、南京16為秈稻品種。試驗材料還包括以南粳9108和金粳818為親本, 配制的雜交種及其衍生的F2群體; 以9311和金粳818為親本, 通過多代回交和自交獲得的抗除草劑高世代品系。將水稻材料種植于試驗田隔離區(qū), 防止花粉外漂, 以常規(guī)方法栽培。

1.2 除草劑處理

所用除草劑為咪草煙(又稱為咪唑乙煙酸), 由南京祥宇農藥有限公司生產, 有效成分含量16%。將水稻種子催芽后, 按450 kg hm–2密度播種。在水稻長至二葉一心時, 排去田里的水, 將咪草煙(水劑)溶液稀釋300倍, 每平方米噴灑70~80 mL, 噴灑24 h后復水, 14 d后調查抗性, 葉片全部枯萎或死亡為感, 植株存活為抗。

1.3 抗性基因的克隆及序列分析

根據日本晴基因編碼區(qū)上下游序列(NC_008395.2)設計測序引物ALSs-F (5￠-TCGCCC AAACCCAGAAAC-3￠)和ALSs-R (5￠-ATGCCAAGC ACATCAAACAA-3￠)。以KOD-Plus (TOYOBO)高保真酶對金粳818基因組序列進行擴增, 擴增產物送往上海Invitrogen公司測序。用軟件DNAMAN進行序列比對分析。

1.4 分子標記設計

基于抗除草劑品種金粳818與感除草劑品種日本晴在基因第1880位堿基的差異, 開發(fā)了11個分子標記(表1), 設置11個引物組合, 分別為S4/S2、S4/S3、S5/S2、S5/S3、S6/S2、S6/S3、S7/S2、S7/S3、S1/S8、S1/S9和S1/S10。部分引物在3￠端引入了堿基錯配。

表1 ALS基因分子標記設計

加粗的小寫字母標識的堿基表示錯配堿基, 下畫線并加粗的堿基表示功能突變位點堿基。

Lowercase and bold letters represent mismatched bases, underlined and bold letters represent the functional mutant base.

1.5 PCR擴增與電泳檢測

用CTAB法提取待檢測水稻葉片的基因組。以提取的基因組DNA為模板, 進行PCR擴增。PCR體系為DNA模板(20 ng μL–1) 2 μL, 10×PCR buffer 2 μL, MgCl2(5 mmol L–1) 2 μL, dNTP (2 mmol L–1) 2 μL, 上游引物(2 μmol L–1) 2 μL, 下游引物(2 μmol L–1) 2 μL,DNA聚合酶(5 U μL–1) 0.2 μL, ddH2O 7.8 μL。擴增條件為94°C 5 min; 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min, 結束反應。在Eppendorf Mastercycle熱循環(huán)儀中進行PCR。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離, 用凝膠成像儀拍照并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 金粳818 ALS基因克隆及其功能標記的開發(fā)

金粳818抗除草劑的表型是由單基因控制的質量性狀, 抗相對于感為顯性。利用SSR標記將金粳818抗除草劑基因定位在第2染色體RM7413和RM7426之間, 其中RM7413與抗性基因緊密連鎖。對這2個標記之間的基因分析發(fā)現, 前人報道的抗咪唑啉酮類除草劑靶標基因位于這一區(qū)段[5,9,11-14]。因此, 我們對金粳818的基因測序, 并與感除草劑粳稻品種日本晴和已報道感除草劑品種StrawhullS的基因[10]比對。結果如圖1所示, 金粳818與日本晴之間存在32處堿基變異, 與StrawhullS之間存在6處堿基變異, 金粳818與日本晴、StrawhullS在1593、1880和1927 bp處均存在變異。其中, 第1880 bp的變異導致第627位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於０?。根據Rajguru等[10]報道, 第1880 bp位點是水稻抗咪唑啉酮類除草劑的一個功能位點, 該位點的變異使得咪唑啉酮類除草劑不會抑制ALS蛋白活性, 從而對咪唑啉酮類除草劑產生抗性。

基于金粳818在基因1880 bp位點上由G到A的變異, 設計了11個引物標記(表1)。以日本晴(感除草劑品種,)和金粳818 ()的基因組為模板進行引物篩選, 以S4/S2、S4/S3、S5/S2、S5/S3、S6/S2、S6/S3、S7/S2、S7/S3、S1/S8、S1/S9和S1/S10引物組合進行PCR擴增。結果如圖2所示, S4/S2及S4/S3僅能在日本晴品種中擴增, 但擴增效率較低。S6/S2、S7/S2和S7/S3僅能在金粳818中擴增。S1/S9能在日本晴中高效擴增, 在金粳818中有微弱擴增; 而S1/S10能在金粳818中高效擴增, 在日本晴中有微弱擴增。

圖1 ALS基因序列比對圖

日本晴的基因序列GenBank登錄號為NC_008395.2, StrawhullS的基因序列GenBank登錄號為AY885673.1。

Thegene sequence of Nipponbare has a GenBank number NC_008395.2, thegene sequence of StrawhullS has a GenBank number AY885673.1.

圖2 不同引物組合對日本晴和金粳818的PCR擴增結果

A為日本晴, B為金粳818; M為DL2000標記, 由大到小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp; 泳道1~11分別為S4/S2、S4/S3、S5/S2、S5/S3、S6/S2、S6/S3、S7/S2、S7/S3、S1/S8、S1/S9和S1/S10。

A: Nipponbare; B: Jinjing 818; M: DL2000 marker (from up to down, 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp). Lanes 1 to 11 represent S4/S2, S4/S3, S5/S2, S5/S3, S6/S2, S6/S3, S7/S2, S7/S3, S1/S8, S1/S9, and S1/S10, respectively.

基于上述擴增結果, 選擇6對分子標記(S4/S2、S4/S3、S5/S2、S5/S3、S1/S9和S1/S10)進一步優(yōu)化條件。PCR體系與之前相同, PCR程序中將退火溫度提高到60°C。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳中分離, 于凝膠成像系統(tǒng)中拍照表明, S4/S2、S4/S3、S5/S2和S5/S3均不能有效擴增出目的條帶(圖3)。而S1/S9僅在日本晴品種中獲得特異有效擴增, S1/S10只在金粳818中獲得單一有效擴增。且這2個引物組合獲得的條帶明亮、清晰, 檢測結果可靠。S1/S9能特異檢測感咪草煙基因型(), S1/S10能特異檢測抗咪草煙基因型()。將S1/S9命名為F1N, S1/S10命名為F1M, 作為檢測抗/感咪草煙的分子標記, 命名為AS-ALS。

2.2 F2群體的AS-ALS標記檢測及表型分析

利用AS-ALS標記檢測金粳818、南粳9108、南粳9108/金粳818雜交種及它們的93個F2單株, 所有攜帶純合和雜合基因型的F2單株都表現抗除草劑, 而所有攜帶純合基因型的F2群體單株均表現感除草劑(圖4和圖5)。分子標記基因型檢測結果與表型鑒定結果完全對應。AS-ALS標記與抗/感除草劑表型完全共分離, 同時還能檢測到抗性雜合基因型, 表明AS-ALS標記可用于抗咪草煙育種的精準選育, 在F2篩選抗性的純合基因型, 可以實現早代選擇。

圖3 引物組合提高退火溫度優(yōu)化后PCR擴增結果

A為日本晴, B為金粳818; M為DL2000標記, 由大到小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp; 泳道1~6分別為S4/S2、S4/S3、S5/S2、S5/S3、S1/S9和S1/S10。

A: Nipponbare; B: Jinjing 818; M: DL2000 marker (from up to down, 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp). Lanes 1 to 6 represent S4/S2, S4/S3, S5/S2, S5/S3, S1/S9, and S1/S10, respectively.

2.3 AS-ALS標記在回交育種中的應用

以金粳818為供體親本, 以9311為輪回親本連續(xù)回交3代, 每一代均對雜交種檢測保留基因型的單株, 與輪回親本回交; 對BC3F2單株保留純合單株, 再自交一代, 結合農藝性狀選擇, 獲得除草劑抗性穩(wěn)定BC3F3株系。圖6為利用AS-ALS標記對農藝性狀優(yōu)良的株系隨機檢測的結果, 表明這些株系都攜帶純合等位基因, 這些株系抗性穩(wěn)定, 不再分離。因此, 利用AS-ALS標記輔助選擇基因可以快速獲得除草劑抗性穩(wěn)定的水稻材料。

圖4 AS-ALS標記檢測部分F2單株及表型對應情況

M為DL2000 DNA標記(由大到小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp), P1為金粳818, P2為南粳9108, F1為南粳9108/金粳818雜交種, 1~21為F2單株; R表示單株表現抗除草劑, S表示單株表現感除草劑。

M: DL2000 marker (from up to down, 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp); P1, Jinjing 818; P2: Nanjing 9108; F1: Jinjing 818/Nanjing 9108; 1-21: the plants of the F2populations; R: resistant to herbicide; S: susceptible to herbicide.

圖5 噴施除草劑后F2植株表型

1為金粳818, 2為南粳9108, 3為南粳9108/金粳818雜交種, 4為純合基因型后代, 5為雜合基因型后代, 6為純合基因型后代。

1: Jinjing 818; 2: Nanjing 9108; 3: Jinjing 818/Nanjing 9108; 4: the plant withgenotype; 5: the plant withgenotype; 6: the plant withgenotype.

2.4 用AS-ALS功能標記篩選水稻資源

如圖7所示, 在檢測的24份水稻品種資源中, 只有金粳818攜帶等位基因, 屬抗除草劑類型; 其他23份材料(20份粳稻: 日本晴、南粳40、南粳41、南粳44、南粳45、南粳46、南粳49、南粳9108、南粳5055、淮稻5號、蘇秀867、武運粳21、武運粳24、武運粳27、徐稻3號、徐稻8號、鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻99、連粳7號、常農粳7號; 3份秈稻: 9311、IR36、南京16)均為等位基因, 表現感除草劑。標記檢測的結果與基因的表型完全對應, 表明功能標記AS-ALS對秈稻和粳稻均具有多態(tài)性, 能同時用于粳稻和秈稻資源的篩選及抗除草劑遺傳改良。

3 討論

隨著國民經濟的迅速發(fā)展和產業(yè)結構調整, 農村勞動力不斷往城市轉移, 水稻直播等輕簡栽培生產發(fā)展迅猛[2]。但在直播稻田里容易發(fā)生草害, 尤其是與直播相伴的雜草稻危害, 已成為影響水稻品質和產量的重要因素。在江蘇省鎮(zhèn)江市揚中縣一帶的直播稻田中, 20世紀90年代后期就發(fā)現了紅米雜草稻[15]。近年來, 在江蘇以北地區(qū)隨著直播稻生產方式的逐年擴大, 雜草稻危害面積呈逐年上升趨勢。雜草稻分類上屬于水稻, 利用稻田除草劑難以清除, 已成為水稻生產難以解決的世界性問題。

圖6 用AS-ALS標記檢測高代品系及表型對應情況

M為DL2000 DNA標記(由大到小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp), P1為金粳818, P2為南粳9108, 1~22為BC3F3群體單株; R表示單株表現抗除草劑, S表示單株表現感除草劑。

M, DL2000 marker (from up to down, 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp); P1: Jinjing 818; P2: Nanjing 9108; 1-22: the plants of the BC3F3populations; R: the plants resistant to herbicide; S: the plants susceptible to herbicide.

圖7 利用AS-ALS功能標記篩選水稻資源

M為DL2000標記, 由大到小分別為2000、1000、750、500、250和100 bp; 泳道1~24分別為金粳818、日本晴、南粳40、南粳41、南粳44、南粳45、南粳46、南粳49、南粳9108、南粳5055、淮稻5號、蘇秀867、武運粳21、武運粳24、武運粳27、徐稻3號、徐稻8號、鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻99、連粳7號、常農粳7號、9311、IR36和南京16。

M: DL2000 marker (from up to down, 2000, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp). Lanes 1-24 represent Jinjing 818, Nipponbare, Nanjing 40, Nanjing 41, Nanjing 44, Nanjing 45, Nanjing 46, Nanjing 49, Nanjing 9108, Nanjing 5055, Huaidao 5, Suxiu 867, Wuyunjing 21, Wuyunjing 24, Wuyunjing 27, Xudao 3, Xudao 8, Zhendao 88, Zhendao 99, Lianjing 7, Changnongjing 7, 9311, IR36, and Nanjing 16.

美國有200多萬公頃水稻, 主要生產方式是機器條播, 紅米雜草稻也是影響美國水稻品質的主要問題之一[16-17]。咪唑啉酮類除草劑是一類廣譜內吸性除草劑, 主要用于大豆田的高效除草, 能有效防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草[3]。美國十多年前推出了抗咪唑啉酮類除草劑的水稻品種, 使得咪唑啉酮類除草劑在防除稻田雜草方面展現出了良好的應用前景。咪唑啉酮類除草劑是一類高效低毒性的除草劑, 但在偏堿性條件下降解較慢, 易對后茬油菜、番茄、馬鈴薯、高粱等作物造成藥害。初步研究發(fā)現, 咪草煙當季殘留對水稻生產影響比較大, 而多年使用咪草煙進行抗性鑒定的試驗田對后茬小麥生產幾乎沒有影響, 為抗咪草煙水稻品種在江蘇稻麥輪作區(qū)生產種植提供了可行性參考, 但對生產應用及環(huán)境影響還有待進一步研究。

咪唑啉酮類除草劑的靶標是乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS), 該酶是細胞中合成側鏈氨基酸的重要催化酶[18-20]。以ALS為靶點的除草劑能與植物體內的ALS蛋白結合, 阻礙側鏈氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成, 使細胞分裂被抑制, 雜草正常生長受到破壞而死亡[21-23]?；虼嬖诒姸鄩A基變異位點, 部分變異引起編碼氨基酸的改變而具有除草劑抗性。本研究發(fā)現金粳818攜帶的基因第627位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於０? 該位點的變異與Rajguru等[10]報道的突變點一致?？钩輨┧静牧辖鹁?18及調控位點的發(fā)現與利用, 對解決水稻直播中雜草稻的危害具有重要的理論和實踐意義。

基因功能標記的開發(fā)和利用能夠加快育種進程。功能標記可以用于基因型選擇, 尤其是對顯性基因, 可以將雜合基因型剔除, 加快目標基因的早代穩(wěn)定, 可以省略表型鑒定過程, 節(jié)省成本, 加快育種進程[24-25]?；诨蚩垢械任换虻?880位由G到A的堿基變異, 設計了一對功能標記—— AS-ALS。該標記能有效區(qū)分感純合基因型、抗雜合基因型、抗純合基因型, 是為針對單堿基突變開發(fā)的等位基因特異PCR分子標記, 只需要同一樣本2次PCR就能區(qū)分3種基因型, 為開展基因抗除草劑分子標記輔助育種奠定了基礎。

4 結論

金粳818抗除草劑目標基因為基因, 該基因第1880堿基為功能突變位點?；谠撐稽c由G到A的堿基變異, 設計了一對功能標記AS-ALS。它是一個等位基因特異PCR標記, 由F1N和F1M組成。F1N能特異擴增基因型, 屬感除草劑類型; F1M能特異擴增基因型, 屬抗除草劑類型; F1N和F1M均能擴增出條帶的樣品為雜合型, 屬抗除草劑類型。AS-ALS標記與抗除草劑表型完全共分離。多代回交和自交并輔以AS-ALS標記選擇, 能快速獲得除草劑抗性穩(wěn)定的水稻材料, 表明該標記能很好地用于分子標記輔助抗咪唑啉酮類除草劑水稻新品種的選育。

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Development and Application of the Functional Marker for Imidazolinone Herbicides ResistantGene in Rice

WANG Fang-Quan1,2, YANG Jie1,2,*, FAN Fang-Jun1,2, LI Wen-Qi1,2, WANG Jun1,2, XU Yang1,2, ZHU Jin-Yan1,2, FEI Yun-Yan1, and ZHONG Wei-Gong1,2

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement / Jiangsu High Quality Rice R&D Center, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Breeding and utilization of herbicide resistant rice are significant to rice production. By screening the rice germplasm, we found the herbicide resistant material “Jinjing 818”. An SNP mutation G to A was present in() gene at 1880 bp position, leading to the alteration from serine (S, AGT) to asparagine (N, AAT), which confers herbicide resistance. In this study, 11 allelic-specific PCR (AS-PCR) primers were designed based on the functional mutation. After optimized these primers, we obtained two primer combinations F1N (S1/S9) and F1M (S1/S10), named AS-ALS marker. Using this marker detected the genetic population, its parents, F1hybrid, F2and also rice collections, inbred lines, showing that the herbicide susceptibleness alleliccould be amplified by F1N, the herbicide resistance allelicby F1M, and heterozygous genotype by F1N and F1M simultaneously. The genotype of those tested materials perfectly matched with the phenotype of herbicide resistance or susceptibleness. Aided by AS-ALS marker selection, the homozygouspedigrees in multi-generation backcross or self-cross showed stable herbicide resistance. Therefore, the allelic-specific PCR functional marker AS-ALS can be used in herbicide breeding efficiently, also screening herbicide resistant rice germplasm. In conclusion, the AS-ALS marker developed in this research is inexpensive and effective in breeding practice.

rice (L.); herbicide; acetolactate synthase;gene; functional marker

2017-07-19;

2017-11-21;

2017-12-11.

10.3724/SP.J.1006.2018.00324

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100400-3), 江蘇省現代農業(yè)重點研發(fā)項目(BE2015355), 江蘇省農業(yè)科學院探索性項目(ZX(17)2014), 江蘇省自然科學基金面上項目(BK20171326)和國家公益性行業(yè)科研專項項目(201303102)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program (2017YFD0100400-3), the Jiangsu Province Key Research and Development Program (Modern Agriculture, BE2015355), the Exploratory Project of the Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (ZX(17)2014), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China (BK20171326), and the Special Fund for Scientific Research on Public Causes (201303102).

Corresponding author楊杰, E-mail: yangjie168@aliyun.com, Tel: 025-84390320

E-mail: wfqjaas@163.com, Tel: 025-84390320

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20171211.0856.022.html