戴冰，楊夢(mèng)琳，張嘉妮，李玉星，周芳亮，肖子曾*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

腎陽虛是指腎陽虛衰，命火不足，陰寒內(nèi)生，以腰膝酸軟、性欲減退、夜尿多[1]為主要臨床表現(xiàn)的一類虛寒癥狀。現(xiàn)代研究表明，腎陽虛與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)中下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸有密切關(guān)系，即腎陽虛患者通常表現(xiàn)為HPT軸功能紊亂[2]，故通過調(diào)節(jié)HPT軸可改善腎陽虛，從而達(dá)到溫補(bǔ)腎陽的目的。

金匱腎氣丸始見于張仲景的《金匱要略》，臨床上常用于腎陽虛引起的腎虛水腫，腰膝酸軟，小便不利等癥狀。該方在重用干地黃、山茱萸、山藥等補(bǔ)腎益精的藥物外，還配伍少量補(bǔ)陽之品桂枝、附子，意微微生火從而鼓舞腎氣[3]。但桂枝-附子二藥在金匱腎氣湯中如何起到溫補(bǔ)腎陽的作用，是否為該方改善腎陽虛的藥效物質(zhì)，目前這些方面的研究尚有不足。故本研究擬通過觀察金匱腎氣湯及桂枝-附子對(duì)HPT軸的影響，來探討桂枝-附子在金匱腎氣湯中溫補(bǔ)腎陽的作用機(jī)理，為解釋金匱腎氣湯“陰中求陽”的配伍關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥物

按金匱腎氣湯(熟地黃24 g、山茱萸12 g、山藥12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g、桂枝3 g、附子3 g)稱取原藥材2劑，再按金匱腎氣湯中桂枝-附子比例(桂枝3 g、附子3 g)稱取藥材2劑，所有飲片均購自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)雌雄各半的昆明種小鼠(KM)60只，體質(zhì)量(20±2)g，均購自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(湘)2013-0004。

1.3 試劑

氫化可的松注射液(安陽九州藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)140820001A)；小鼠環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)、小鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(R&D systems)；碘[125I]三碘甲狀腺原氨酸(T3)、碘[125I]甲狀腺素(T4)放射免疫分析藥盒(批號(hào)150820)、碘[125I]促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析藥盒(批號(hào)150820)(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.4 主要儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；小型冷凍離心機(jī)(型號(hào)：centrifuge 5415R)；羅氏全自動(dòng)生化儀(型號(hào)：Modular DPP)；Motic B5 顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)；Shandon 325 型石蠟切片機(jī)(英國Shandon公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

金匱腎氣湯及桂枝-附子兩組藥材中附子先煎60 min ，再加入其他藥材，分別加6倍量的水浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min，合并2次藥液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥1.5 g/ml的濃縮液。

2.2 分組及給藥

取雌雄各半的KM小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成空白組、腎陽虛模型組、金匱腎氣湯組、桂枝-附子組，每組15只。分組后第2天開始，金匱腎氣湯組(10.53 g生藥/kg)、桂枝-附子組(0.78 g生藥/kg)按相應(yīng)劑量灌胃給藥，空白組及模型組每日灌胃蒸餾水，連續(xù)15 d。

2.3 腎陽虛模型的制備

在第6～15 d，小鼠在每日下午15時(shí)按照25 mg/kg劑量灌胃氫化可的松注射液，建立腎陽虛模型?？瞻捉M小鼠則灌胃蒸餾水。

2.4 標(biāo)本采集與處理

各組大鼠末次給藥后禁食24 h，即實(shí)驗(yàn)第16天摘眼球取血，并立即分離血清、血漿；并摘取甲狀腺組織將其置于10%甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 癥狀觀察、體質(zhì)量測(cè)定

每日觀察并記錄小鼠日常癥狀，測(cè)量并記錄造模后小鼠體質(zhì)量的變化。

2.5.2 cAMP、cGMP含量測(cè)定

小鼠摘眼球取血后，將血液置于常溫下30 min，離心15 min(3 500 r/min)，收集上清液后按小鼠環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)及小鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。

2.5.3 T3、T4及 TSH含量測(cè)定

小鼠摘眼球取血后，將血液置于常溫下30 min，離心15 min(3 500 r/min)，收集上清液后按碘[125I]三碘甲狀腺原氨酸(T3)、碘[125I]甲狀腺素(T4)放射免疫分析藥盒及碘[125I]促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析藥盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。

2.5.4 甲狀腺組織病理形態(tài)改變觀察

將各組小鼠甲狀腺均置于10%甲醛中固定，并經(jīng)過常規(guī)梯度脫水、二甲苯透明后，浸蠟、石蠟包埋，切片3～5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，并在常規(guī)顯微鏡下觀察各甲狀腺組織形態(tài)的變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)腎陽虛模型小鼠體質(zhì)量、癥狀的影響

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量在造模后有顯著性差異(P<0.01)，且模型組小鼠還出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍，蜷曲拱背等癥狀。與腎陽虛模型組比較，金匱腎氣丸組體質(zhì)量有顯著性差異(P<0.01)，小鼠反應(yīng)靈活、毛發(fā)有光澤，少有蜷曲拱背現(xiàn)象出現(xiàn)。提示腎陽虛模型小鼠體質(zhì)量降低，金匱腎氣湯能改善模型小鼠腎陽虛癥狀，可使體質(zhì)量增加，而桂枝-附子則對(duì)其無影響。結(jié)果見表1。

表1 對(duì)腎陽虛模型小鼠體質(zhì)量的影響

注：與空白組比較，**P<0.01；與腎陽虛模型組比較，△△P<0.01

3.2 對(duì)腎陽虛模型小鼠血漿cAMP及cAMP/cGMP比值的影響

與空白組比較，模型組血漿cAMP及cAMP/cGMP比值有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，金匱腎氣湯組、桂枝-附子組血漿cAMP及cAMP/cGMP比值有顯著性差異(P<0.01)。提示金匱腎氣湯和桂枝-附子均能抑制模型小鼠cAMP及cAMP/cGMP比值下降的趨勢(shì)。結(jié)果見表2。

表2 對(duì)腎陽虛模型小鼠血漿cAMP、cAMP/cGMP的影響

注：與空白組比較，**P<0.01；與腎陽虛模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.3 對(duì)腎陽虛模型小鼠血清中T3、T4、TSH濃度的影響

與空白組比較，模型組血清中T3、T4及TSH濃度有顯著性差異(P<0.01)；與腎陽模型組比較，金匱腎氣湯組、桂枝-附子組血清中T3、T4及TSH濃度有顯著性差異(P<0.01)。表明模型小鼠血清中T3、T4及TSH濃度降低，提示金匱腎氣湯、桂枝-附子均能緩解模型小鼠血清中T3、T4及TSH濃度下降的趨勢(shì)。結(jié)果見表3。

表3 對(duì)腎陽虛模型小鼠血清TSH、T3、T4的影響

注：與空白組比較，**P<0.01；與腎陽虛模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.4 對(duì)腎陽虛模型小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響

空白組可見該甲狀腺的濾泡為呈圓形、橢圓形，內(nèi)部為紅染膠質(zhì)，濾泡間未見水腫，上皮細(xì)胞無增生。模型組可見該甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞不完整，大部分濾泡膠質(zhì)稀薄或缺失；金匱腎氣湯組可見該甲狀腺濾泡壁上皮細(xì)胞完整，濾泡未見腫大，內(nèi)部為紅染膠質(zhì)，無稀薄或缺失；桂枝-附子組濾泡壁上皮細(xì)胞完整，但大部分濾泡膠質(zhì)稀薄或缺失。提示模型小鼠甲狀腺組織受損，金匱腎氣湯能修復(fù)模型小鼠受損的甲狀腺組織，但桂枝-附子二藥修復(fù)作用不明顯。結(jié)果見圖1。

4 討論

cAMP、cGMP是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的既相互拮抗又相互制約的重要物質(zhì)[4]，對(duì)細(xì)胞功能處于穩(wěn)定狀態(tài)具有雙向調(diào)控作用，與中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的“陰陽學(xué)說”有許多共同點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)腎陽虛患者的血漿中cAMP含量降低，cAMP/cGMP比值下降，可以對(duì)腎陽虛模型進(jìn)行評(píng)價(jià)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣湯、桂枝-附子二藥均可使其血漿cAMP水平、cAMP/cGMP比值升高，改善腎陽虛證。

圖1 對(duì)腎陽虛模型小鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)的影響(HE，10×40)

下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸是由下丘腦、垂體與甲狀腺組成的神經(jīng)內(nèi)分泌功能軸之一，調(diào)節(jié)著機(jī)體內(nèi)外環(huán)境之間的相互平衡[6]。該軸中下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素(TRH)通過一系列途徑使垂體門脈系統(tǒng)刺激腺垂體細(xì)胞分泌促甲狀腺激素(TSH)，而TSH是直接調(diào)節(jié)甲狀腺形態(tài)和功能的重要激素，其既可促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生，又能促進(jìn)T3和T4的合成與釋放，參與機(jī)體基礎(chǔ)代謝等多種功能活動(dòng)[7]。而內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙是虛證的重要表現(xiàn)之一，腎陽虛患者常表現(xiàn)為HPT軸功能抑制[8]，即表現(xiàn)為HPT軸中下丘腦分泌TRH與垂體分泌TSH減少，從而抑制甲狀腺濾泡釋放T3、T4。本研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣湯及桂枝-附子二藥均能上調(diào)甲狀腺濾泡分泌的T3、T4水平，升高HPT軸中垂體分泌的TSH水平。故桂枝-附子可能為金匱腎氣湯溫發(fā)揮補(bǔ)腎陽作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，該方的溫補(bǔ)腎陽的作用機(jī)制可能通過升高HPT軸中甲狀腺分泌的T3、T4和垂體分泌的TSH,從而改善腎陽虛證有關(guān)。

[1] 翟武杰,于春泉.腎陽虛證癥狀表現(xiàn)規(guī)律的臨床研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2011,32(8):22-23.

[2] 沈自尹.中西醫(yī)結(jié)合腎本質(zhì)研究回顧[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(3):304-306.

[3] 張蕙,張榮春,倪誠.地黃類中成藥臨床應(yīng)用辨析[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(7):2178-2181.

[4] 梁汝圣,徐宗佩.大鼠腎陰陽虛模型建立方法[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28(9):685-687.

[5] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:1028.

[6] 戴冰,楊夢(mèng)琳,張嘉妮,等.六味地黃湯及其“一補(bǔ)一瀉”藥對(duì)對(duì)腎陰虛模型小鼠HPT軸的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(6):19-22.

[7] 朱大年.生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:388-396.

[8] 金蓉家,楊元宵,邢桂英,等.腎氣丸對(duì)腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調(diào)節(jié)作用初探[J].浙江中醫(yī)雜志,2013,48(5):370-371.