劉曉瑩，鄒偉，于學(xué)平

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，全球每年約有200萬人患病[1-4]，是一種病情危急，擁有高致殘率和高死亡率的疾病。炎癥反應(yīng)參與了腦出血的發(fā)生和病情發(fā)展，IL-1β作為免疫反應(yīng)的中央?yún)f(xié)調(diào)器和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵觸發(fā)點(diǎn)，其表達(dá)情況直接體現(xiàn)腦出血炎癥反應(yīng)的程度[5]。針灸治療腦出血療效已得到廣泛肯定，對(duì)其作用機(jī)制的研究也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究利用大鼠腦出血模型，觀察針刺對(duì)ICH大鼠腦組織IL-1β mRNA及血清IL-1β表達(dá)的影響，探究針刺治療腦出血可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

將162只成年健康雄性SD大鼠(哈爾濱市獸醫(yī)研究所)，體質(zhì)量(300±20)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(S,n=18)、模型組(M,n=72)和針刺組(A,n=72)；模型組和針刺組按造模成功后6 h、12 h、24 h和72 h分為4個(gè)亞組(n=18)。

1.2 ICH造模及模型成功標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)改良過的Rosenberg[6]方法制備大鼠腦出血模型。假手術(shù)組大鼠斷尾，取血，微量注射器進(jìn)針等操作與模型組相同，但不進(jìn)行注血，進(jìn)針后留針5 min。采用Zea Longa[7]5分制評(píng)分作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，1～3分表明造模成功。

1.3 干預(yù)方法

針刺組：大鼠按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》選取百會(huì)穴、曲鬢穴。局部消毒后，手持針灸針(0.30 mm×25 mm)快速進(jìn)針，并向右下方曲鬢穴透刺，進(jìn)針深度15 mm，以200 r/min小幅度捻轉(zhuǎn)。每間隔5 min捻針1次，每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min，共留針30 min，每12 h針刺1次。

假手術(shù)和模型組：每天與針刺組相同時(shí)間點(diǎn)抓取1次，并固定30 min，不予以針刺。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

參照mNSS神經(jīng)功能評(píng)分系統(tǒng)[8]對(duì)各時(shí)間點(diǎn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.5 腦水含量測(cè)定

分別于造模后6 h、12 h、24 h、72 h將大鼠斷頭取腦，并分離左、右側(cè)大腦半球。每部分分離后立即稱重(濕重)，放置于105℃恒溫干燥箱中干燥72 h后再次稱重(干重)。腦水含量百分比計(jì)算公式為：[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.6 ELISA法檢測(cè)IL-1β水平

大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)，取腹主動(dòng)脈血5 mL，室溫靜置20 min，用離心機(jī)以3 000 r/min的速度離心20 min，分離上層血清，-20℃冰箱冷凍備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行IL-1β測(cè)定，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)

按RNAiso Plus(Takara公司)說明書要求提取腦組織中的RNA。應(yīng)用PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，(Takara，D6210A)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如下：內(nèi)參基因 β-actin : f:AACACCCCAGCCATGTACGTA;r:TGGCCATCTCTTGCTCGAA;目標(biāo)基因IL-1β: f:AAGGGGACATTAGGCAGCAC;r:ATGAAAGACCTCAGTGCGGG。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min后，冰上冷卻。用Takara,SYBR Premix Ex Taq kit進(jìn)行RT-PCR。

Real time PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;( 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s)×40循環(huán),目的基因相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct值表示[9]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析結(jié)合Tukey檢驗(yàn)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果

如圖1、表1所示，與假手術(shù)組相比,各時(shí)間點(diǎn)模型組評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比,相同時(shí)間點(diǎn)針刺組評(píng)分明顯降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

圖1 各組神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠腦水含量檢測(cè)結(jié)果

如圖2、表2所示，與假手術(shù)組相比,各時(shí)間點(diǎn)模型組腦水含量顯著升高(P<0.05)； 6 h、12 h時(shí)間點(diǎn)針刺組與模型組腦水含量無顯著差異(P>0.05)；24 h、72 h時(shí)間點(diǎn)針刺組腦水含量較相同時(shí)間點(diǎn)模型組明顯降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。

圖2 各組腦水含量測(cè)定結(jié)果注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05 ；與模型組比較，#P<0.05

2.3 各組大鼠ELISA結(jié)果比較

如圖3、表3所示，與假手術(shù)組相比，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠血清IL-1β水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,同一時(shí)間點(diǎn)針刺組IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。

表2 各組大鼠腦水含量檢測(cè)結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

表3 各組大鼠血清IL-1β含量測(cè)定結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.4 Real-time PCR結(jié)果

如圖4、表4所示，與假手術(shù)組相比，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠IL-1β mRNA水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,同一時(shí)間點(diǎn)針刺組IL-1β mRNA水平顯著降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠腦組織IL-1β mRNA相對(duì)含量

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

圖3 各組血清IL-1β含量測(cè)定結(jié)果注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05 ；與模型組比較， #P<0.05

圖4 各組腦組織IL-1βmRNA相對(duì)含量注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05 ；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

腦出血?jiǎng)偘l(fā)生后，血液大量累積直接壓迫周圍腦組織，迅速發(fā)生一系列細(xì)胞和分子的病理過程。這種細(xì)胞和炎癥的激活觸發(fā)單核細(xì)胞浸潤(rùn)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、血腦屏障的破壞以及腦水腫的發(fā)展，嚴(yán)重影響繼發(fā)性腦損傷的損傷程度[9-11]。大鼠發(fā)生腦出血后血腫周圍很快有白細(xì)胞浸潤(rùn)和小膠質(zhì)細(xì)胞聚集。這些細(xì)胞吞噬清除壞死的腦組織,釋放炎性細(xì)胞因子、蛋白酶、氧自由基等多種物質(zhì)，殺傷神經(jīng)元,參與遲發(fā)性神經(jīng)元損傷[12]。IL-1β作為免疫反應(yīng)的中央?yún)f(xié)調(diào)器和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵觸發(fā)點(diǎn)[6]，是腦損傷的重要因素。不僅可以直接損傷神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)其凋亡,還增強(qiáng)黏附因子的表達(dá),增加微血管通透性,引發(fā)腦水腫。IL-1β腦內(nèi)注射可以導(dǎo)致血管源性腦水腫[13]。研究腦出血誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和腦水腫的病理生理機(jī)制已成為治療腦出血的潛在靶點(diǎn)。

針灸作為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在降低中風(fēng)患者致殘率，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等方面的療效顯著，已在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可[14-16]。雖然已有研究證實(shí)針灸在改善中風(fēng)后神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[15]，抑制細(xì)胞凋亡，緩解神經(jīng)功能損傷[17]等方面療效確切，但針灸治療腦出血的有效性及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn)。我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，針刺“百會(huì)”透刺“曲鬢”可以通過促進(jìn)腦出血急性期內(nèi)源性GDNF表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)重塑作用[18]；通過抑制Notch1 和 Hes1蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的再生和修復(fù)[19]；也可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有效改善腦損傷[20]；并且通過抑制NF-κB經(jīng)典通路，有效拮抗腦出血炎性腦損傷[16]。在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們通過對(duì)腦出血大鼠模型IL-1β水平檢測(cè)及腦水含量的觀察發(fā)現(xiàn)，針刺“百會(huì)”透“曲鬢”有效降低了ICH大鼠腦組織IL-1β mRNA及血清中IL-1β的水平，控制了腦水腫進(jìn)展，改善了腦出血后神經(jīng)功能障礙。

綜上所述，針刺“百會(huì)”透“曲鬢”穴，通過降低腦出血大鼠IL-1β表達(dá)水平，起到抑制腦水腫，降低神經(jīng)功能損傷的作用。

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