李 俊 盧 陽 劉永翔 劉 輝

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省薯類工程研究中心，貴州 貴陽 550006)

乳酸菌(Lactobacillus)是指能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的總稱，目前已發(fā)現(xiàn)的這類菌至少有20多個(gè)屬[1]。乳酸菌具有協(xié)調(diào)人體腸道菌群的比例、控制病原菌、減少感染、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力、改善乳糖不耐癥、抗輻射等一系列作用[2-3]。目前，與乳酸菌相關(guān)的發(fā)酵奶制品、活菌凍干粉等產(chǎn)品已經(jīng)被廣大消費(fèi)者接受，但乳酸菌發(fā)酵乳制品中高膽固醇含量和消費(fèi)者中存在的乳糖不耐受現(xiàn)象成為了乳酸菌發(fā)酵奶制品的兩個(gè)弊端。近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)健康的關(guān)注度越來越高，對(duì)非牛乳的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的需求也越來越大，非牛乳乳酸菌飲料的開發(fā)也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。袁金祥[4]以山藥為原料，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌為發(fā)酵劑，通過護(hù)色、糖化、發(fā)酵等工藝條件的篩選和優(yōu)化，研制出一種純山藥的乳酸菌發(fā)酵飲料。徐安書等[5]以優(yōu)質(zhì)莖瘤芥葉子原汁和胡蘿卜汁為原料，嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌為菌種，研制出了滅菌型和活菌型2種蔬菜汁復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)是一種重要的小宗雜糧作物和藥食同源植物，含有蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維、不飽和脂肪酸、植物甾醇、D-手性肌醇等，營養(yǎng)素含量豐富，比例均衡[6-7]。利用苦蕎發(fā)酵，已經(jīng)開發(fā)出苦蕎醋、苦蕎酸奶及苦蕎酒等各種特色保健食品[8-10]。但現(xiàn)階段關(guān)于乳酸菌發(fā)酵對(duì)苦蕎制品中營養(yǎng)成分的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過乳酸菌發(fā)酵制成苦蕎芽苗飲料，并研究發(fā)酵過程對(duì)苦蕎芽苗飲料品質(zhì)和營養(yǎng)成分的影響，以期闡明苦蕎中的營養(yǎng)物質(zhì)在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化，為苦蕎制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎籽粒：貴米苦18號(hào)，由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供，在25 ℃、相對(duì)濕度80%條件下萌發(fā)8～10 d制取萌發(fā)苦蕎芽苗；

苦蕎茶：貴州省威寧縣東方神谷有限責(zé)任公司；

保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心；

蘆丁、槲皮素、山奈酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：美國 Sigma公司；

果葡糖漿、黃原膠、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、海藻酸鈉：食品級(jí)，加福得食品(北京)有限公司；

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、無水亞硫酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、鹽酸、酚酞、考馬斯亮藍(lán)-G250、磷酸：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：1290型，配二極管陣列檢測器，美國Agilent公司；

高速破壁調(diào)理機(jī)：JYL-Y92型，九陽股份有限公司；

均質(zhì)機(jī)：BRS-200型，安徽博進(jìn)化工機(jī)械有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HHS型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

分析天平：CP213型，奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2102C型，尤尼科上海儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦蕎芽苗茶飲料加工工藝流程

苦蕎茶與苦蕎芽苗按照4∶1(質(zhì)量比)的比例混勻后打漿，用4層紗布過濾雜質(zhì)后，在4 000 r/min離心5 min，按照1∶10(體積比)的比例加入純凈水進(jìn)行稀釋，然后添加1%的果葡糖漿、0.06%的黃原膠、0.08%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、0.05%的海藻酸鈉，均質(zhì)后在121 ℃條件下滅菌5 min，然后按0.6%的菌劑添加量接種乳酸菌(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌)，37 ℃發(fā)酵24 h后無菌灌裝，即為苦蕎芽苗活菌飲料。飲料置于4 ℃冰箱中12 h后測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 指標(biāo)測定

(1) 感官評(píng)定：參照文獻(xiàn)[11]。

(2) 總酸度測定：按GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的酸堿滴定法(以乳酸計(jì))執(zhí)行。

(3) 乳酸菌含量測定：按GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》執(zhí)行。

以上每個(gè)樣品均重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1.3.3 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法[12]。以蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)X，吸光值為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y= 0.318 6X+0.002，R2= 0.999 1。取飲料液1 mL，按照上述步驟進(jìn)行操作，所有樣品都平行測定3次，取A510的平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的總黃酮含量(mg/mL)。

1.3.4 總糖和還原糖含量測定 參照程柳等[13]的方法，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.033 1X-0.019 3，R2=0.999 3。

(1) 還原糖樣品測定：取飲料液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟進(jìn)行操作。

(2) 總糖樣品測定：取飲料液5 mL，加入6 mol/L的HCl溶液10 mL和蒸餾水15 mL，混勻，在沸水浴中加熱30 min 后，用碘化鉀—碘溶液檢查水解程度。待水解完全后，冷卻，加入酚酞指示劑0.2 mL，以6 mol/L的NaOH溶液中和至溶液呈酚酞變色，定容至50 mL，即為總糖待測樣品。取待測液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟進(jìn)行操作。

所有樣品都平行測定3次，取A489的平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的總糖和還原糖含量(mg/mL)。

1.3.5 總蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]。以蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.005 7X+0.006 4，R2=0.998 8。取飲料液2 mL，按照上述步驟進(jìn)行操作，所有樣品都平行測定3次，取A595的平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的總蛋白含量(μg/mL)。

1.3.6 不同黃酮組分分析 根據(jù)文獻(xiàn)[15]，修改如下：取蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚4種對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每100 mL分別含蘆丁100 mg，山奈酚-3-O-蕓香糖苷50 mg，槲皮素20 mg 及山奈酚20 mg 的混合溶液，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。取5.0 mL飲料，置具塞錐形瓶中，加入75%乙醇50 mL，超聲30 min，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，過濾，即得供試品溶液。色譜條件：Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇(A)∶0.1%磷酸溶液(B)=55∶45(體積比)；檢測波長355 nm。柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin(Version 8.6)進(jìn)行作圖，采用SPSS(Version 17.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵對(duì)苦蕎芽苗飲料感官品質(zhì)的影響

從圖1中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，感官評(píng)分先緩慢升高后迅速降低，植物乳桿菌在發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大值(93.50±0.46)，保加利亞乳桿菌在發(fā)酵時(shí)間為30 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大值(91.20±0.62)，嗜熱鏈球菌在發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大值(89.10±0.28)，說明3種乳酸菌及混合發(fā)酵都能使產(chǎn)品的風(fēng)味更佳，且植物乳桿菌發(fā)酵效果最好，混菌發(fā)酵時(shí)保加利亞乳桿菌+植物乳桿菌(1∶1)的感官評(píng)分最高(95.10±0.71)，說明保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵過程中有一定的協(xié)同作用，使產(chǎn)品的風(fēng)味更好。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)感官評(píng)分的影響Figure 1 Effects of different lactobacillus fermentation on sensory score

2.2 苦蕎芽苗飲料中乳酸菌活菌數(shù)的測定

從圖2可以看出，發(fā)酵24 h之前，3種乳酸菌迅速增殖，處于對(duì)數(shù)生長期，發(fā)酵超過24 h后，乳酸菌含量趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h后，乳酸菌含量開始緩慢下降，可能是乳酸菌開始進(jìn)入衰亡期，或者飲料液中營養(yǎng)成分消耗過多，不能滿足乳酸菌繼續(xù)增殖，與陳曉維等[16]報(bào)道的結(jié)果一致。在發(fā)酵24 h時(shí)，植物乳桿菌發(fā)酵液中乳酸菌含量最高，達(dá)到1.17×107CFU/mL，嗜熱鏈球菌中乳酸菌含量最低，達(dá)到3.90×106CFU/mL，說明苦蕎芽苗飲料中營養(yǎng)豐富，適合乳酸菌生長。

2.3 乳酸菌發(fā)酵對(duì)苦蕎芽苗飲料中總糖和還原糖含量的影響

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，3種乳酸菌及混菌發(fā)酵液中總糖含量均逐漸降低，在發(fā)酵24 h前，總糖含量降低的速度較緩慢，在24～30 h時(shí)，總糖含量下降迅速，此時(shí)菌種正處于穩(wěn)定期，活菌數(shù)達(dá)到最高，所以糖利用的速度最快，此后隨著糖含量降低以及菌種老化，糖分解的速度逐漸變緩。由圖4可以看出，3種乳酸菌及混菌發(fā)酵液中還原糖含量均呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵過程中，植物乳桿菌中還原糖含量下降最快，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中還原糖含量下降較慢，且混菌發(fā)酵液中還原糖含量下降趨勢(shì)相近。發(fā)酵48 h后總糖含量最多下降了24.8%，還原糖含量最多下降了34.2%。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵的活菌數(shù)Figure 2 The number of live bacteria fermented by different lactobacillus

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)總糖含量的影響Figure 3 Effects of different lactobacillus fermentation on total sugar

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)還原糖含量的影響Figure 4 Effects of different lactobacillus fermentation on reducing sugar

2.4 乳酸菌發(fā)酵對(duì)苦蕎芽苗飲料中總酸含量的影響

從圖5可以看出，苦蕎芽苗飲料初始總酸含量為(0.14±0.02) μg/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，不同乳酸菌發(fā)酵液中總酸含量均呈升高趨勢(shì)，其中植物乳桿菌產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在發(fā)酵48 h產(chǎn)酸量最多，達(dá)到(4.26±0.16) μg/mL，嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸能力最弱，為(3.06±0.15) μg/mL，說明植物乳桿菌將苦蕎芽苗飲料中糖轉(zhuǎn)化為酸的能力較其他2種乳酸菌更強(qiáng)，植物乳桿菌在苦蕎芽苗飲料中的適應(yīng)性更好。

2.5 乳酸菌發(fā)酵對(duì)苦蕎芽苗飲料中總蛋白含量的影響

從圖6可以看出，苦蕎芽苗飲料初始總蛋白含量為(33.96±0.25) μg/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，不同乳酸菌發(fā)酵液中總蛋白含量均呈下降趨勢(shì)，可能是乳酸菌將飲料液中的蛋白質(zhì)作為生長用的氮源，導(dǎo)致其不斷分解。植物乳桿菌分解能力最強(qiáng)，其增殖能力也較其他2種乳酸菌較高，發(fā)酵48 h后總蛋白含量降低了58.6%。保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及混菌發(fā)酵的總蛋白降低趨勢(shì)基本相近，嗜熱鏈球菌的分解能力最弱，保加利亞乳桿菌次之。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)總酸含量的影響Figure 5 Effects of different lactobacillus fermentation on total acid

圖6 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)總蛋白含量的影響Figure 6 Effects of different lactobacillus fermentation on total protein

2.6 乳酸菌發(fā)酵對(duì)苦蕎芽苗飲料中黃酮含量的影響

由表1可知，經(jīng)過3種乳酸菌發(fā)酵48 h后，保加利亞乳桿菌發(fā)酵液中總黃酮含量下降了3.9%，嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中總黃酮含量下降了4.4%，植物乳桿菌發(fā)酵液中總黃酮含量下降了5.0%，下降并不顯著，發(fā)酵并未造成苦蕎芽苗飲料中總黃酮含量顯著降低。采用高效液相色譜法對(duì)苦蕎芽苗飲料中含量最高的4種黃酮類物質(zhì)蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、山奈酚含量進(jìn)行測定，其中山奈酚在苦蕎芽苗飲料中未檢出，其他3種成分在發(fā)酵前含量分別為(84.5±2.1)，(11.3±0.9)，(7.9±0.4) μg/mL。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，3種乳酸菌發(fā)酵液中蘆丁含量基本保持穩(wěn)定，說明發(fā)酵對(duì)蘆丁并未造成影響，槲皮素含量均有不同程度降低，其中植物乳桿菌發(fā)酵液中槲皮素降解最多，發(fā)酵48 h后含量為(6.9±0.8) μg/mL，可能是發(fā)酵使槲皮素分解為其他成分。發(fā)酵對(duì)山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量也有一定的影響，發(fā)酵48 h 后，嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中的含量最低，為(5.2±0.9) μg/mL。因此，乳酸菌發(fā)酵會(huì)造成苦蕎芽苗飲料液中黃酮類物質(zhì)少量分解，但其分解機(jī)理及產(chǎn)物仍需進(jìn)一步研究。

表1 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)黃酮類物質(zhì)的影響Table 1 Effects of different lactobacillus fermentation on flavonoids

3 結(jié)論

通過添加果葡糖漿，乳酸菌能夠較好地在苦蕎芽苗飲料中生長。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌的發(fā)酵活性較其他2種乳酸菌高，其活菌數(shù)最高，且植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵有一定的協(xié)同作用，得到的產(chǎn)品感官評(píng)分最高。不同菌種發(fā)酵造成飲料液中總糖和還原糖含量下降，發(fā)酵48 h后總糖含量最多下降了24.8%，還原糖含量最多下降了34.2%。植物乳桿菌在發(fā)酵48 h產(chǎn)酸量最多，達(dá)到(4.26±0.16)μg/mL，嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸能力最弱，為(3.06±0.15) μg/mL?？嗍w芽苗飲料中的蛋白質(zhì)被乳酸菌作為發(fā)酵過程中的氮源，發(fā)酵48 h后其總蛋白含量最多降低了58.6%。乳酸發(fā)酵對(duì)蘆丁沒有影響，但會(huì)造成槲皮素和山奈酚-3-O-蕓香糖苷少量分解。試驗(yàn)確定了苦蕎芽苗飲料最佳的乳酸菌發(fā)酵菌種為植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌(接種量1∶1)混合發(fā)酵，對(duì)產(chǎn)品的營養(yǎng)成分影響較小。