馮雙雙 陳劉通 廖晨 白莉

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率、病死率最高的疾病之一。吸煙是COPD發(fā)病的最主要的危險(xiǎn)因素。吸煙所致高氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)狀態(tài)下肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷/凋亡是COPD發(fā)生氣道重塑、肺氣腫的病理學(xué)基礎(chǔ)[1-5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)可調(diào)控OS狀態(tài)下細(xì)胞存活或凋亡[6-8]。Obg樣ATP酶1(Obg-like ATPase1, OLA1)是抗OS的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控因子，其表達(dá)水平的降低對(duì)OS狀態(tài)下的細(xì)胞具有保護(hù)作用[9-12]。前期研究也發(fā)現(xiàn)下調(diào)OLA1的細(xì)胞可減輕多種細(xì)胞ERS水平[13]。鑒于OS/ERS途徑與吸煙相關(guān)COPD形成過(guò)程中肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞的損傷/凋亡密切相關(guān)，我們推測(cè)從OLA1入手調(diào)控OS/ERS有可能逆轉(zhuǎn)香煙暴露下肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷/凋亡，阻止COPD的發(fā)生。本文通過(guò)檢測(cè)人肺組織中OLA1、OS指標(biāo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malonaldehyde, MDA)及ERS相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein of 78kD, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)表達(dá)水平，探討人肺組織標(biāo)本中OLA1表達(dá)水平與OS水平、ERS活化程度的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象肺組織標(biāo)本來(lái)自2014年1月至2015年1月陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科行肺葉切除術(shù)的24例肺癌患者。取材均為伴或不伴COPD并行肺葉切除的肺癌患者臨床標(biāo)本，遠(yuǎn)離原發(fā)癌灶5 cm以上且肉眼觀(guān)察無(wú)肺癌浸潤(rùn)的外周肺組織。根據(jù)患者有無(wú)吸煙史將病例分為三組，每組各8例，最低年齡42歲，最高年齡72歲。非吸煙肺功能正常組，男6例，女2例，平均年齡(56.37±10.14)歲。吸煙肺功能正常組，男7例，女1例，平均年齡(56.75±2.12)歲。吸煙COPD組，男7例，女1例，平均年齡(60.75±8.55)歲。COPD的診斷符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)修訂頒布的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[8]，即患者吸入支氣管擴(kuò)張劑后肺功能FEV1/FVC<70%，且不合并其他慢性疾病，手術(shù)前一周均處于穩(wěn)定期。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有除慢性阻塞性肺疾病以外的慢性肺部疾病、糖尿病、冠心病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。本研究項(xiàng)目經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))新橋醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1. 試劑和儀器： 抗OLA1抗體、抗SOD抗體、抗MDA抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam公司，抗CHOP抗體、抗GRP78抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，倒置顯微鏡為日本Olympus公司。

2. 肺組織免疫組化染色及結(jié)果判定： 4%多聚甲醛固定肺組織標(biāo)本，石蠟包埋切片、修復(fù)、封閉后滴加Ⅰ抗：抗OLA1抗體(1︰100)、抗SOD抗體(1︰200)、抗MDA抗體(1︰400)、抗CHOP抗體(1︰200)、抗GRP78抗體(1︰200)，PBS漂洗后滴加Ⅱ抗：山羊抗兔抗體(1︰400)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染5 min后封片，最后鏡檢。結(jié)果分析：顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞染色程度(無(wú)顯色，0分；淡黃色，1分；淺褐色，2分；深褐色，3分)及陽(yáng)性范圍(0～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分)，兩者分?jǐn)?shù)相乘為最終分?jǐn)?shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較釆用LSD檢驗(yàn)；兩指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson線(xiàn)性相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床基本資料

三組患者年齡、性別比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；吸煙COPD組體重指數(shù)明顯低于非吸煙肺功能正常組和吸煙肺功能正常組(P<0.05)；吸煙肺功能正常組和吸煙COPD組患者均有長(zhǎng)期吸煙史，兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；非吸煙肺功能正常組和吸煙肺功能正常組肺功能FEV1%pred和FEV1/FVC均在正常范圍，但吸煙肺功能正常組肺功能較非吸煙肺功能正常組有所下降，吸煙COPD組肺功能明顯低于非吸煙肺功能正常組和吸煙肺功能正常組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

二、OLA1、氧化應(yīng)激指標(biāo)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在肺組織中表達(dá)情況

免疫組化半定量分析結(jié)果顯示OLA1、OS指標(biāo)SOD、MDA及ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP在人肺組織支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，OLA1、MDA、GRP78、CHOP在吸煙COPD組和吸煙肺功能正常組中表達(dá)明顯高于非吸煙肺功能正常組(P<0.05)，吸煙COPD組高于吸煙肺功能正常組(P<0.05)，SOD在吸煙COPD組和吸煙肺功能組中表達(dá)明顯低于非吸煙肺功能正常組(P<0.05)，吸煙COPD組低于吸煙肺功能正常組(P<0.05)，圖1和表2。

三、OLA1表達(dá)水平與OS水平、ERS活化程度的相關(guān)性分析

Pearson直線(xiàn)相關(guān)分析，OLA1在人肺組織中表達(dá)與OS指標(biāo)SOD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.643，P<0.01)，與MDA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.793，P<0.01)；與ERS相關(guān)蛋白GRP78呈正相關(guān)(r=0.815，P<0.01)、與CHOP表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.843，P<0.01)。

討 論

吸煙是COPD發(fā)病的最重要的危險(xiǎn)因素。吸煙所致高OS狀態(tài)下肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷/凋亡是COPD發(fā)生氣道重塑、肺氣腫的病理學(xué)基礎(chǔ)。既往研究證實(shí)由于肺部慢性炎癥和支氣管上皮細(xì)胞損傷，SOD的合成能力下降，SOD活性降低，MDA水平增高，從而導(dǎo)致機(jī)體失代償[14]。有研究證實(shí)氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物MDA在吸煙相關(guān)COPD患者血清中表達(dá)水平高于非吸煙健康者，抗氧化酶SOD表達(dá)水平對(duì)比非吸煙健康者明顯降低，且MDA與SOD表達(dá)水平呈負(fù)性相關(guān)[15-16]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)人肺組織中OS指標(biāo)MDA在吸煙組患者(吸煙肺功能正常組和吸煙COPD組)肺組織中表達(dá)高于非吸煙患者(非吸煙肺功能正常組)，在吸煙COPD患者高于吸煙肺功能正?；颊?，抗氧化酶SOD表達(dá)則與MDA表達(dá)相反，SOD在吸煙患者肺組織中的表達(dá)低于非吸煙患者，在吸煙COPD患者肺組織中表達(dá)低于吸煙肺功能正?；颊摺１狙芯拷Y(jié)果說(shuō)明與非吸煙肺功能正?；颊呦啾?，吸煙患者肺內(nèi)OS失衡更嚴(yán)重，提示肺內(nèi)OS失衡在吸煙相關(guān)COPD的發(fā)病機(jī)制中可能起一定作用。

ERS是調(diào)控包括OS等多種應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活或凋亡的重要途徑，研究證實(shí)OS、ERS與糖尿病、哮喘、肺纖維化等慢性疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)[3-6,17-24]。大量證據(jù)表明香煙煙霧觸發(fā)肺內(nèi)ERS并介導(dǎo)肺部細(xì)胞損傷/凋亡，參與COPD的發(fā)病機(jī)制[4,25]。應(yīng)激條件下，ERS通路被激活，GRP78表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊，以減輕ERS，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，起到一種細(xì)胞保護(hù)性機(jī)制的作用。CHOP作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)促凋亡蛋白，在過(guò)度ERS情況下大量表達(dá)，參與細(xì)胞損傷/凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)CHOP、GRP78在吸煙相關(guān)COPD患者肺泡灌洗液中表達(dá)增高。研究不吸煙者、吸煙者、吸煙COPD患者肺組織中人支氣管上皮細(xì)胞(normal human bronchial epithelial cell, NHBE)中GRP78、CHOP表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)吸煙者與吸煙COPD患者NHBE中GRP78、CHOP表達(dá)高于不吸煙者，吸煙COPD患者的表達(dá)水平又高于吸煙者[26-29]。與上述研究結(jié)果相似，本研究中我們發(fā)現(xiàn)GRP78、CHOP在吸煙患者肺組織中表達(dá)增高，其中吸煙COPD患者表達(dá)高于吸煙肺功能正?；颊撸狙芯拷Y(jié)果說(shuō)明與非吸煙肺功能正?；颊邔?duì)比，吸煙患者肺組織ERS活化程度加重，提示ERS通路激活可能參與了吸煙COPD的發(fā)病機(jī)制。

表1 三組患者臨床基本資料比較

表2 三組患者肺組織中OLA1、SOD、MDA、GRP78、CHOP的表達(dá)

圖1 OLA1、OS指標(biāo)SOD、MDA及ERS相關(guān)蛋白GRP89、CHOP在人肺組織中的表達(dá)(×200)；注：A：非吸煙肺功能正常組；B：吸煙肺功能正常組；C：吸煙COPD組

OLA1是新近確認(rèn)的抗OS內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)OLA1表達(dá)可減輕細(xì)胞內(nèi)ERS，ERS調(diào)控OS可促使細(xì)胞存活或者凋亡[30-33]。本究顯示OLA1在吸煙COPD患者和吸煙肺功能正常肺組織中表達(dá)明顯高于非吸煙患者，其中吸煙COPD患者肺組織表達(dá)又高于吸煙肺功能正?；颊?；提示OLA1表達(dá)上調(diào)可能參與吸煙相關(guān)COPD的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步對(duì)OLA1表達(dá)水平和OS、ERS標(biāo)志物表達(dá)相關(guān)性分析顯示，OLA1表達(dá)水平與OS指標(biāo)MDA、ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP呈正相關(guān)，與OS指標(biāo)SOD水平呈負(fù)相關(guān)，提示抗OS負(fù)性調(diào)控因子OLA1的表達(dá)與OS和ERS水平一致，表明OLA1可能是通過(guò)調(diào)控OS/ERS調(diào)控肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷/凋亡，進(jìn)而參與COPD的發(fā)生。

綜上所述，OLA1可能是通過(guò)調(diào)控OS/ERS調(diào)控肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷/凋亡，進(jìn)而參與COPD的發(fā)生。對(duì)其進(jìn)行深入研究有助于揭示OLA1、OS、ERS在吸煙相關(guān)COPD發(fā)病中的作用機(jī)制，對(duì)了解吸煙相關(guān)COPD的發(fā)病和治療具有重要意義。