陳喆鳴，南麗紅，謝晴晴，黃 枚

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

腦缺血再灌注損傷是腦缺血疾病中常見的現(xiàn)象，其病理生理過程十分復(fù)雜，主要包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、Ca2＋超載等，最終引起神經(jīng)細胞凋亡乃至壞死。近年來研究已證實腦缺血再灌注損傷引起的活性氧蓄積和細胞內(nèi)Ca2＋紊亂極易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），繼而導(dǎo)致細胞凋亡，這可能是神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。因此，ERS成為三大調(diào)控細胞凋亡的主要細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。栝樓桂枝湯出自《金匱要略》，已有研究表明栝樓桂枝湯具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗興奮性氨基酸毒性的作用［2-3］，而課題組前期研究亦表明栝樓桂枝湯通過調(diào)控多條信號通路發(fā)揮保護神經(jīng)作用，減少腦梗死體積［4-5］，具有抗神經(jīng)細胞凋亡的作用［6］，但其作用是否與ERS相關(guān)，目前尚未見相關(guān)報道。因此，本研究以ERS為切入點，觀察栝樓桂枝湯對ERS關(guān)鍵蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 （glucosere-gulatedprotein，GRP78）、轉(zhuǎn)錄活化因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）、C／EBP 同源蛋白（C／EBP homology protein，CHOP）及其下游細胞凋亡相關(guān)指標(biāo)B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell leukemia／lymphoma gene number 2，Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）mRNA 表達的影響，為其促進腦卒中后神經(jīng)功能康復(fù)提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（270±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（浙）2014-0001，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗藥物 大棗（北京同仁堂健康藥業(yè)福州有限公司，批號：20150910）；甘草（福州回春中藥飲片廠有限公司，批號：15060901）；桂枝（亳州市永剛飲片廠有限公司，批號：160113）；天花粉（北京同仁堂健康藥業(yè)福州有限公司，批號：20151202）；白芍（北京同仁堂健康藥業(yè)福州有限公司，批號：20151123），生姜（福建承創(chuàng)堂藥店）；尼莫地平（山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責(zé)任公司，批號：150601）。

1.3 實驗試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQTMSYBR?Color qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；氯仿（衡陽市凱信化工試劑有限公司）；異丙醇（廣東省化學(xué)式工程技術(shù)開發(fā)研究中心）；無水乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.4 實驗儀器 ABI 7900實時熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司）；PrimoR臺式高速冷凍離心機（美國 Thermo Fisher公司）；C1000TMThermal Cycler PCR儀（美國Bio-rad公司）。

1.5 PCR引物 PCR引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司參照Gen Bank數(shù)據(jù)庫合成并驗證。GRP78：上游 5'-GACCTGGTTCTGCTTGATGTG-3'，下游5'-TCGTTCACCTTCGTAGACCTT-3'；ATF4：上游 5'-GCCTGACTCTGCTGCTTATATTAC-3'，下游 5'-CGA GAACCACGAGGAACAC-3'；CHOP：上游 5'-CCTCG CTCTCCAGATTCCA-3'，下游 5'-CTCCTGCTCCTTC TCCTTCA-3'；Bcl-2：上游 5'-GATGACTTCTCTCGT CGCTACCGT-3'，下游 5'-GGAGAAATCAAACAGA GGTCGCAT-3'；Caspase-3：上游 5'-ACGGCAAGTT CAACGGCACAG-3'，下游 5'-TGTGAACTTGGTTGG CTTGT-3'；GAPDH：上游 5'-CAACGGGAAACCCA TCACCA-3'，下游 5'-ACGCCAGTAGACTCCACGAC AT-3'。

2 實驗方法

2.1 栝樓桂枝湯的制備 稱取2個處方量的藥材：栝樓根 60 g，桂枝 18 g，白芍 18 g，大棗 18 g，生姜18 g，甘草12 g，將藥材初步粉碎，置于圓底燒瓶中，加入10倍量的超純水浸泡30 min后回流提取，共2次，每次1.5 h。紗布過濾后，合并濾液。將藥液濃縮到100 mL至實驗所需濃度1.44 g／mL。

2.2 分組、造模與干預(yù) 將大鼠隨機分為假手術(shù)組和造模組，造模組建立大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，具體操作：將大鼠按60 mg／kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉，頸部皮膚消毒后切開，鈍性分離左側(cè)胸鎖乳突肌，暴露大鼠頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈；用縫合線于近心端結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，用血管夾夾閉頸內(nèi)動脈血流；于頸總動脈剪一切口，往頸內(nèi)動脈方向插入線栓，栓塞2 h后拔出。假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作相同。待動物完全蘇醒后進行Longa神經(jīng)功能評分［7］，神經(jīng)功能評分3～4分視為造模成功，評分過程至少由2人同時進行。

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。于造模當(dāng)日待大鼠完全清醒后，低、中、高劑量組分別予栝樓桂枝湯按 3.6、7.2、14.4 g／（kg·d）灌胃，陽性對照組給予尼莫地平混懸液按 1.05 g／（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 神經(jīng)功能損傷評分 采用Longa神經(jīng)學(xué)評分法［7］對干預(yù)7 d后6組大鼠進行評分。大鼠神經(jīng)功能無缺陷，記0分；缺血側(cè)對側(cè)前肢無法伸展，記1分；缺血側(cè)對側(cè)前肢屈曲，記2分；大鼠輕度向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈，記3分；若嚴重轉(zhuǎn)圈，記4分；大鼠向缺血側(cè)對側(cè)偏癱，記5分。

2.3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子基因表達 采用實時熒光定量 PCR法檢測大鼠皮質(zhì) GRP78、ATF4、CHOP、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達情況。使用Trizol法提取大腦皮質(zhì)總RNA，參照試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，通過RT-qPCR檢測指標(biāo)基因的表達。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中 Mix 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模版 DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 擴增條件為 95 ℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s后退火至60℃變性30 s，共進行40個循環(huán)，熔解曲線以機器本身默認程序獲得。本研究選用GAPDH為內(nèi)參，計算各組樣品的2－△△Ct值并進行歸一化處理。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，方差齊者采用單因素方差分析LSD檢驗法，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗法；等級資料采用非參數(shù)檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 6組大鼠神經(jīng)功能損傷評分比較 見表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能損傷評分比較（） 分

表1 6組大鼠神經(jīng)功能損傷評分比較（） 分

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組n 14 14 14 14 14 14神經(jīng)功能損傷評分0 2.86±0.771）1.43±0.512）2.29±0.473）1.64±0.632）1.50±0.522）

3.2 6組大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達比較 見表2。

表2 6組大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達比較（n＝6，）

表2 6組大鼠皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達比較（n＝6，）

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組GRP78 1.04±0.27 2.10±0.191）1.14±0.233）1.72±0.143）1.41±0.223）1.01±0.093）ATF4 1.01±0.12 2.29±0.361）1.24±0.163）1.44±0.193）1.49±0.243）1.54±0.223）CHOP 1.06±0.34 1.90±0.331）1.20±0.203）1.41±0.244）1.04±0.393）1.11±0.233）Bcl-2 1.05±0.35 0.52±0.212）0.90±0.114）0.81±0.134）0.91±0.164）0.83±0.164）Caspase-3 1.02±0.20 1.90±0.121）1.16±0.113）1.48±0.093）1.30±0.143）1.23±0.083）

4 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由內(nèi)膜構(gòu)成的封閉網(wǎng)狀細胞器，是真核細胞中Ca2＋貯存和蛋白質(zhì)合成、折疊、轉(zhuǎn)運的主要場所，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細胞正常生理活動中發(fā)揮重要作用［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變化十分敏感。ERS是由于細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞后引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，其與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切。最初，Petito等［9］通過電鏡發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)改變并伴有遲發(fā)性神經(jīng)元死亡；Paschen［10］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞具有發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且腦缺血后出現(xiàn)ERS，提示ERS參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。隨后的研究指出腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞容易引起蛋白合成受阻，大量未折疊或者錯誤折疊的蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。 UPR 是介導(dǎo) ERS最重要的信號機制，其在ERS初期對細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)具有積極的意義，但持續(xù)的應(yīng)激將會激活下游的細胞凋亡信號通路，引起細胞凋亡［11］。

GRP78與CHOP是ERS的特征性指標(biāo)，二者的病理性表達水平升高預(yù)示著ERS的發(fā)生以及由其介導(dǎo)細胞凋亡途徑的激活［12］。在正常生理狀態(tài)下，GRP78與相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白以復(fù)合物的形式存在，抑制ERS的激活；但當(dāng)腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，GRP78將會解離并大量表達，促使ATF4轉(zhuǎn)錄、翻譯并發(fā)生轉(zhuǎn)位，進而上調(diào)CHOP表達水平［13-14］。CHOP是ERS和細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵節(jié)點，是ERS特異性的中間信號分子。其在正常生理狀態(tài)下表達水平較低，但當(dāng)ERS發(fā)生時CHOP的表達水平將會升高，并抑制下游Bcl-2的表達，進而促進Caspase-3的釋放以及Caspase依賴性凋亡途徑的激活［15］。

本研究結(jié)果顯示，栝樓桂枝湯可明顯減輕MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能癥狀，這與前期的研究結(jié)果相一致［4］。本研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)MCAO模型大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)中 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA 表達明顯增多，而Bcl-2 mRNA的表達明顯減少，提示腦缺血再灌注損傷后ERS的啟動以及其下游細胞凋亡信號通路的激活。栝樓桂枝湯治療后可明顯下調(diào) GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA的表達，上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達，提示栝樓桂枝湯可顯著下調(diào)ERS水平，抑制下游凋亡通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮治療作用。mRNA是蛋白翻譯的模板，基因的表達是蛋白表達的基礎(chǔ)和前提。本研究由于時間和經(jīng)費所限，目前雖只檢測基因表達，但為今后進一步研究上述基因及其上下游蛋白的表達提供前期實驗基礎(chǔ)。

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