駱江龍 李 鯤 馮 旭

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

當今世界肺癌的發(fā)病率仍然高居不下，文獻[1]顯示肺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中已處于第一的位置，并且男性和女性的發(fā)病率都處于首位。發(fā)展中國家和發(fā)達國家也沒有因為醫(yī)療環(huán)境的差異而有所變化，死亡率可能不一樣，發(fā)病率大致差不多。預計到未來10年，肺癌在全世界仍將是新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤。目前肺癌的治療手段有很多種，包括常規(guī)的手術治療和放化療，近期的生物靶向治療也有所進展。早期肺癌采取常規(guī)手術治療一般可起到根治的效果。但當前肺癌治療效果較差，難以達到預期效果，這主要歸因于早期肺癌并無明顯癥狀，且早期篩查手段診斷率不高，大部分在醫(yī)院就診的肺癌患者已發(fā)展到中晚期階段，并且晚期肺癌并沒有效果明顯的治療手段[1]。

肺癌的常規(guī)診斷技術是CT和X線等影像學手段，但是這些診療技術不利于鑒別肺癌的早期情況。近年來表觀遺傳學的發(fā)展，讓我們可以將視角轉(zhuǎn)向分子和基因檢測等層面。早期檢測和鑒別患者基因分子的變化情況，可能將是未來早期診斷肺癌的有力手段。有證據(jù)表明[2]抑癌基因的異常甲基化是導致基因失活的一個重要機制。本實驗利用甲基化特異性PCR法分別檢測肺癌、肺良性病變患者血漿中p16、DAPK和APC基因的甲基化情況，分析啟動子DNA甲基化介導的基因在肺癌中的沉默以及具有潛在危險因素的無癌癥對照可能為肺癌的預測提供線索?，F(xiàn)報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2015年6月至2016年10月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診，行手術治療且術后經(jīng)本院病理科檢測確診為非小細胞肺癌的患者79例為研究對象，其中男57例，女22例，年齡35～80歲，中位年齡63.27歲。按2015版WHO肺癌組織學分類標準[3]：鱗癌37例，腺癌40例。按國際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標準[4]：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期50例。有淋巴結轉(zhuǎn)移的32例，無淋巴結轉(zhuǎn)移的47例。患者均排除其他惡性腫瘤病史且未行化療或放療等其他治療。同時選擇廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科同年住院治療的40例肺部非惡性腫瘤患者為對照組，其中男28例，女12例，年齡19～78歲，中位年齡57.23歲。對照組均排除肺部或其他器官的惡性腫瘤病史，其中支氣管擴張16例，支氣管肺炎9例，慢性阻塞性肺疾病(COPD)5例，肺結核4例，支氣管哮喘、特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、自發(fā)性氣胸、胸腔積液、炎性假瘤及肺囊腫各1例。病例資料的收集均征得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 患者均于治療前抽取清晨空腹外周靜脈血2 mL，ACD抗凝，2 000 r/min離心15 min分離血漿，再以12 000 r/min離心15 min，獲得無血細胞成分的血漿，以1.5 mL試管分裝，于-80℃保存待檢測。

1.2.2 血漿DNA提取 采用天根生物科技有限公司(北京)的血液組織細胞基因組提取試劑盒，分別對肺癌組和對照組進行基因組DNA提取，提取過程按照試劑盒說明操作。采用紫外線分光光度計測定純度和含量來判斷提取結果。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 采用Epigentek公司的Methylamp Universal Methylated DNA Kit試劑盒進行基因甲基化修飾，具體操作步驟按說明書。

1.2.4 MSP 參照文獻[5-6]設計p16基因、DAPK基因和APC基因引物，分別識別甲基化特異性序列(M) 和非甲基化特異性序列(U)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及MSP反應條件見表1。PCR設計流程同文獻[5]。

1.3 甲基化判定標準 PCR產(chǎn)物出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因甲基化；出現(xiàn)未甲基化條帶，而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因未甲基化；甲基化條帶和未甲基化條帶均出現(xiàn)的樣品，也判定為基因甲基化。

表1 MSP所用的引物序列及產(chǎn)物片斷長度

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)；靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)；陰性預測值=真陰性/(真陰性+假陰性)；陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)[7]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 DNA甲基化檢測結果 p16、DAPK和APC基因啟動子甲基化結果見圖1～圖3。肺癌組外周血標本中p16、DAPK和APC基因啟動子甲基化率分別為51.9%(41/79)、50.6%(40/79)、35.4%(28/79)，對照組患者外周血標本中p16、DAPK和APC基因啟動子甲基化率分別為2.5%(1/40)、5.0%(2/40)、2.5%(1/40)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MSP電泳結果見圖1～圖3。

圖1 p16基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖。Marker：DNA marker；M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；P1：甲基化陽性對照；P2：甲基化陰性對照；1-3：肺癌組織；4：空白對照。

圖2 DAPK基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖。Marker：DNA marker； M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；P1：甲基化陽性對照；P2：甲基化陰性對照；1：空白對照；2-4：肺癌組織。

圖3 APC基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖。Marker：DN A marker；M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；P1甲基化陽性對照；P2：甲基化陰性對照；1-3：肺癌組織；4：空白對照。

2.2 p16、DAPK和APC基因甲基化與臨床資料的分析 79例肺癌患者外周血中p16、DAPK和APC基因甲基化狀態(tài)與臨床資料的比較分析結果見表2。3個基因的甲基化率與肺癌患者性別、年齡、吸煙史、組織學類型、腫瘤分期和淋巴結轉(zhuǎn)移等多項臨床特征方面均無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 外周血p16、DAPK和APC基因甲基化水平與肺癌患者臨床特征之間的關系

2.3 p16、DAPK和APC基因甲基化測定對肺癌的診斷效果 外周血p16、DAPK和APC基因甲基化的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結果見表3。單個基因甲基化的靈敏度p16和DAPK基因相對更高、分別為51.9%、50.6%，APC基因比前兩者較低，為35.4%。但是3個基因的特異度差別不大，分別為97.5%、95.5%、97.5%。多個基因的聯(lián)合檢測肺癌可明顯提高靈敏度(73.4%)，但特異度有所下降(90%)。

表3 外周血p16、DAPK、APC基因甲基化的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值 (%)

3 討 論

當前腫瘤臨床診斷研究的熱點主要在基因和蛋白兩個方面，通過血清學檢測基因和蛋白可初步鑒別腫瘤，但是大多數(shù)指標的準確率相對較低[8]，并且腫瘤的發(fā)展過程與多個因素有關，因此發(fā)現(xiàn)一個或者多個與腫瘤關系最密切的因子，對于惡性腫瘤的早期診斷和早期篩查具有顯著的指導作用。

p16基因定位于人類染色體9p21，由2個內(nèi)含子及3個外顯子組成。P16蛋白是p16基因編碼的細胞周期抑制性蛋白，可調(diào)節(jié)細胞的分裂和增殖。Yan等[9]薈萃分析表明p16基因在肺癌患者中發(fā)生甲基化現(xiàn)象非常普遍，基因的甲基化發(fā)生在肺癌形成早期階段，并且具有高度的特異性和低度的敏感性。彭再梅等[10]研究表明p16基因的異常甲基化與患者的臨床特征無相關性。本實驗佐證了p16基因甲基化現(xiàn)象在肺癌早期就已經(jīng)出現(xiàn)，有望成為肺癌早期診斷的指標之一。

DAPK基因定位于人類染色體 9q34.1，可參與調(diào)控多種細胞生理過程，與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關[11]。Tang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，相比于未甲基化的肺癌患者，DAPK基因異常甲基化顯著降低了肺癌患者的5年存活率。國外研究顯示，DAPK可能是克服對抗EGFR藥物抗性以提高治療效果的新靶點，DAPK甲基化有作為藥物反應的潛在生物標志物的可能[13-14]。本研究也顯示了DAPK基因異常甲基化和肺癌的相關性。

APC基因位于人類染色體5q21，含21個外顯子，該基因有控制細胞的死亡或成長的功能，可以有效控制細胞的數(shù)量。Schneikert等[15]研究表明，APC基因啟動子異常甲基化不僅僅是肺癌患者的孤立現(xiàn)象，還出現(xiàn)在其他腫瘤，如結直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等。Feng等[16]的研究表明，APC基因啟動子甲基化與腫瘤患者臨床特征有關聯(lián)的主要是腫瘤分期、淋巴結轉(zhuǎn)移和吸煙；而本研究中APC基因甲基化與性別、年齡、吸煙史、組織學類型、腫瘤分期和淋巴結轉(zhuǎn)移等臨床資料均無相關性，這可能與研究中樣本和研究方法的差異有關。Huang等[17]對151項研究行薈萃分析提示，APC基因是鑒別鱗癌和腺癌的一個重要指標。本研究未發(fā)現(xiàn)APC基因甲基化在鱗癌和腺癌之間的差異，也許需要進一步的研究。

本研究中，對肺癌患者血漿中3個基因的甲基化檢測結果發(fā)現(xiàn)，單個檢測結果靈敏度分別為51.9%(41/79)、50.6%(40/79)、35.4%(28/79)，雙項聯(lián)合檢測靈敏度為62.0%(49/79)、69.3%(50/79)、59.5%(47/79)，三項聯(lián)合檢測靈敏度為73.4%(58/79)，隨著檢測項目的增多，聯(lián)合檢測可明顯提高靈敏度，但是特異度卻有所下降。這表明多個項目聯(lián)合檢測可有助于患者門診的篩查。

綜上所述，p16、DAPKA和APC基因啟動子的異常甲基化伴隨著肺癌的產(chǎn)生和發(fā)展，在肺癌的早期階段均已出現(xiàn)，都有望成為肺癌早期診斷的指標。值得注意的是，肺良性疾患組中均出現(xiàn)了p16、DAPK和APC基因的異常甲基化，是否是肺癌發(fā)生的預兆，這需要下一步的研究證明。今后，我們將找尋更多的可以在肺癌診斷中發(fā)揮作用的因子，并對比各因子的檢測費用和準確率，從中選出最好的并且適合推廣的常規(guī)檢測手段。

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