劉 妍， 袁應(yīng)華

（同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072）

替加環(huán)素是一種甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物，具有廣譜抗菌活性，且臨床使用方便，不需根據(jù)腎功能受損情況調(diào)整劑量[1-2]。雖然大規(guī)模的監(jiān)測(cè)研究表明，替加環(huán)素對(duì)大多數(shù)臨床常見(jiàn)分離菌株（除銅綠假單胞菌外）的耐藥率仍然在10%以下，但隨著臨床的廣泛應(yīng)用，替加環(huán)素耐藥問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，已有一些研究表明替加環(huán)素耐藥率在產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）、多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）、廣泛耐藥（extensive drug resistance，XDR）、耐碳青霉烯類藥物的細(xì)菌中出現(xiàn)升高[3-5]。由于目前美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）仍缺乏關(guān)于替加環(huán)素體外敏感性試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)替加環(huán)素體外敏感性的方法影響因素較多，所以替加環(huán)素敏感性檢測(cè)方法的選擇需慎重[6]。

本研究分析耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性，希望通過(guò)試驗(yàn)比較，找到適合臨床實(shí)驗(yàn)室的用于替加環(huán)素體外敏感性檢測(cè)的方法，以便為臨床使用替加環(huán)素治療耐碳青霉烯類藥物細(xì)菌感染提供盡可能快速和可靠的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院2013年11月—2014年2月臨床分離，并經(jīng)Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱Vitek 2）菌種鑒定和Vitek 2、紙片擴(kuò)散法體外藥物敏感性試驗(yàn)確認(rèn)為耐碳青霉烯類藥物的菌株，其中肺炎克雷伯菌20株、鮑曼不動(dòng)桿菌41株。在受試菌株中，31%來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房，41%來(lái)源于急診重癥室，18%來(lái)源于腦外科。將菌株置40%甘油肉湯-20 ℃冷凍保存。藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）。

1.2 儀器與試劑

Vitek 2及配套革蘭陰性菌鑒定卡GN和革蘭陰性菌藥物敏感性卡GN13均為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品，替加環(huán)素最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)試條為意大利Liofilchem公司產(chǎn)品，替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，水解酪蛋白胨肉湯和替加環(huán)素、阿米卡星等藥物敏感性紙片均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3 體外藥物敏感性試驗(yàn)

將61株冷凍保存的菌株復(fù)蘇并傳代，采用Vitek 2進(jìn)行菌種鑒定，Vitek 2、紙片擴(kuò)散法、MIC法、微量肉湯稀釋法進(jìn)行包括替加環(huán)素在內(nèi)的藥物敏感性試驗(yàn)。Vitek 2及配套細(xì)菌鑒定卡GN、藥物敏感性卡GN13、MIC測(cè)試條均嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法參照CLSI推薦的方法[7-8]進(jìn)行操作。

1.4 藥物敏感性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

替加環(huán)素敏感性的判讀標(biāo)準(zhǔn)[1，9]：肺炎克雷伯菌參照美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）腸桿菌科標(biāo)準(zhǔn)，MIC法敏感、耐藥的判讀標(biāo)準(zhǔn)分別為≤2 mg/L、≥8 mg/L，紙片擴(kuò)散法敏感、耐藥的判讀標(biāo)準(zhǔn)分別為≥19 mm、≤14 mm；鮑曼不動(dòng)桿菌參照FDA鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)，MIC法敏感、耐藥的判讀標(biāo)準(zhǔn)分別為≤2 mg/ L、≥8 mg/L，紙片擴(kuò)散法敏感、耐藥的判讀標(biāo)準(zhǔn)分別為≥16 mm、≤12 mm。其他抗菌藥物的敏感性：參照CLSI M100-S25文件中關(guān)于腸桿菌科以及不動(dòng)桿菌屬的判讀標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行判讀?；疽恢滦裕╡ssential agreement，EA）為被評(píng)估方法MIC值與微量肉湯稀釋法MIC值相差不超過(guò)1個(gè)稀釋度的菌株百分比。分類一致性（categorical agreement，CA）為被評(píng)估方法藥物敏感性結(jié)果（敏感、中介、耐藥）與微量肉湯稀釋法一致的菌株百分比。非常重大誤差（very major error，VME）為被評(píng)估方法將耐藥誤判為敏感。重大誤差（major error，ME）為被評(píng)估方法將敏感誤判為耐藥。小誤差（minor error，mE）為被評(píng)估方法將中介報(bào)告為耐藥或敏感，或?qū)⒛退?、敏感?bào)告為中介。可接受范圍為：CA≥90%，EA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)除替加環(huán)素外的其他臨床常用抗菌藥物的敏感性分析

除對(duì)左氧氟沙星、米諾環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢哌酮-舒巴坦外，41株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率均＞90.0%。見(jiàn)表1。

表1 41株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性[%（株）]

除對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、米諾環(huán)素外，20株肺炎克雷伯菌對(duì)其余抗菌藥物耐藥率均≥90.0%。見(jiàn)表2。

表2 20株肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性[%（株）]

2.2 3種檢測(cè)方法對(duì)于替加環(huán)素的敏感性分析

20株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率、中介率和敏感率，紙片擴(kuò)散法結(jié)果分別為5.0%、70.0%、25.0%，MIC法結(jié)果分別為0.0%、5.0%、95.0%，微量肉湯稀釋法結(jié)果分別為5.0%、0.0%、95.0%。見(jiàn)表3。

檢測(cè)41株耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率、中介率、敏感率，紙片擴(kuò)散法分別為17.1%、82.9%、0.0%，MIC法分別為0.0%、41.5%、58.5%，微量肉湯稀釋法分別為7.3%、29.3%、63.4%。見(jiàn)表3。

2.3 MIC法和紙片擴(kuò)散法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)結(jié)果的比較

MIC法檢測(cè)替加環(huán)素的敏感性結(jié)果與微量肉湯稀釋法比較，20株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的EA、CA、VME、ME、mE均在可接受范圍內(nèi)，而41株耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌的CA和mE欠佳。紙片擴(kuò)散法與微量肉湯稀釋法比較，EA、CA、VME、ME、mE不理想。見(jiàn)表4。

2.4 61株細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素和米諾環(huán)素的敏感性分布

采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)41株耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素和米諾環(huán)素的敏感性，結(jié)果顯示二者同時(shí)耐藥2株，同時(shí)中介2株，米諾環(huán)素中介而替加環(huán)素敏感17株，米諾環(huán)素耐藥而替加環(huán)素中介10株，米諾環(huán)素耐藥而替加環(huán)素敏感9株，還有1株為替加環(huán)素耐藥而米諾環(huán)素中介。

表3 3種方法檢測(cè)耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性

表4 MIC法和紙片擴(kuò)散法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)結(jié)果的比較 [%（株）]

采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)20株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素和米諾環(huán)素的敏感性，結(jié)果顯示二者同時(shí)敏感14株，一致率為70%。米諾環(huán)素中介或耐藥株替加環(huán)素的MIC值有不同程度的升高。

3 討論

本研究61株細(xì)菌對(duì)大部分抗菌藥物的耐藥率為90.0%～100.0%，由于XDR定義[11]中所涉及的部分抗菌藥物無(wú)法常規(guī)檢測(cè)，因而將本研究所選菌株定義為耐碳青霉烯類藥物細(xì)菌，其中31%樣本來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房，41%的樣本來(lái)自急診重癥室，18%的樣本來(lái)自腦外科，這些科室均為醫(yī)院感染監(jiān)控重點(diǎn)科室，也是醫(yī)院耐碳青霉烯類藥物細(xì)菌檢出率居前3位的科室，主要以鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌為主。上述科室大多數(shù)患者具有病情嚴(yán)重且復(fù)雜、住院時(shí)間較長(zhǎng)、自身免疫力低下、長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥物、接受侵入性操作（如手術(shù)、中心靜脈置管、氣管插管等）普遍且頻繁等特點(diǎn)，產(chǎn)生對(duì)替加環(huán)素耐藥的相關(guān)因素較多。替加環(huán)素的耐藥常出現(xiàn)于包含替加環(huán)素在內(nèi)的抗菌藥物治療以及碳青霉烯類藥物使用之后，其耐藥性的發(fā)生、發(fā)展可能與這些抗菌藥物的選擇性壓力有關(guān)；此外，在某些部位的感染（如尿路感染、血流感染和腹腔膿腫等）存在時(shí)，由于替加環(huán)素本身的藥物濃度分布以及體內(nèi)代謝特點(diǎn)，細(xì)菌常常暴露于亞抑菌濃度狀態(tài)下，這也可能是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)其不敏感的因素之一[12-14]。因此，應(yīng)當(dāng)重視這些科室的耐碳青霉烯類細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素敏感性的監(jiān)測(cè)。本研究結(jié)果顯示，耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的敏感率為95.0%，而耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感率僅為63.4%。

本研究采用MIC法檢測(cè)耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性。MIC測(cè)試條類似于E-test測(cè)試條，MIC法因操作簡(jiǎn)便，適用于單個(gè)樣本的檢測(cè)，而較容易應(yīng)用于臨床[1-2，6]。本研究結(jié)果顯示，MIC法檢測(cè)耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性在使用FDA標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀時(shí)與微量肉湯稀釋法具有很好的一致性；而對(duì)耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，CA和mE超出可接受范圍，因此其結(jié)果需謹(jǐn)慎對(duì)待[2]。

雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，紙片擴(kuò)散法不適合用于耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素敏感性的檢測(cè)[2]，但由于微量肉湯稀釋法操作較繁瑣，MIC法成本較高，均不適用于臨床常規(guī)篩查，因此本研究還是同時(shí)使用了紙片擴(kuò)散法進(jìn)行替加環(huán)素敏感性分析。與微量肉湯稀釋法比較，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)2種細(xì)菌的耐藥率、中介率上升，敏感率下降，且2種細(xì)菌CA、mE等評(píng)價(jià)指標(biāo)超出可接受范圍，但多數(shù)菌株為微量肉湯稀釋法敏感而紙片擴(kuò)散法中介或微量肉湯稀釋法中介而紙片擴(kuò)散法耐藥，未出現(xiàn)微量肉湯稀釋法耐藥而紙片擴(kuò)散法敏感的結(jié)果。

從本研究61株細(xì)菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率分析可見(jiàn)，米諾環(huán)素仍然表現(xiàn)出一定的抗菌活性，其對(duì)耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的敏感率、中介率、耐藥率分別為70.0%、20.0%、10.0%，對(duì)耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感率、中介率、耐藥率分別為0.0%、48.8%、51.2%。本研究就米諾環(huán)素和替加環(huán)素的敏感性分布進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌二者結(jié)果一致率較低；對(duì)于耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌結(jié)果一致率為70%，并且米諾環(huán)素中介或耐藥株替加環(huán)素的MIC值有不同程度升高。

綜上所述，替加環(huán)素對(duì)耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌有較好的抗菌活性，而對(duì)耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌活性下降，臨床仍然需要對(duì)耐碳青霉烯類藥物菌株進(jìn)行替加環(huán)素抗菌活性的監(jiān)測(cè)，尤其是在多重耐藥高發(fā)的重點(diǎn)科室。對(duì)于耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌，MIC法檢測(cè)替加環(huán)素結(jié)果與微量肉湯稀釋法有較好的一致性，因此推薦MIC法用于臨床常規(guī)檢測(cè)或復(fù)核確認(rèn)，而耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC法檢測(cè)結(jié)果需謹(jǐn)慎對(duì)待，必要時(shí)用微量肉湯稀釋法進(jìn)行確認(rèn)。雖然各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)不支持使用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行替加環(huán)素敏感性分析，但在臨床實(shí)驗(yàn)條件有限的情況下，可將紙片擴(kuò)散法作為篩查手段，需注意對(duì)于不敏感菌株應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎解釋，或進(jìn)一步使用微量肉湯稀釋法確認(rèn)。耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對(duì)米諾環(huán)素和替加環(huán)素的敏感性結(jié)果的一致率為70%，并且米諾環(huán)素中介或耐藥株替加環(huán)素的MIC值有不同程度升高，因此對(duì)米諾環(huán)素敏感的耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌可嘗試先使用替加環(huán)素紙片擴(kuò)散法篩查，結(jié)果不敏感時(shí)可再考慮進(jìn)行MIC法或微量肉湯稀釋法復(fù)核。

[1] 王輝，俞云松，王明貴，等. 替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程專家共識(shí)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（7）：584-587.

[2] 杜小幸，王海萍，傅鷹，等. 不同藥敏方法檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌敏感性的比較[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（7）：598-603.

[3] POURNARAS S，KOUMAKI V，SPANAKIS N，et al. Current perspectives on tigecycline resistance in Enterobacteriaceae：susceptibility testing issues and mechanisms of resistance[J]. Int J Antimicrob Agents，2016，48（1）：11-18.

[4] 趙春江，陳宏斌，王輝，等. 2013年全國(guó)13所教學(xué)醫(yī)院院內(nèi)血流感染及院內(nèi)獲得性肺炎和院內(nèi)獲得性腹腔感染常見(jiàn)病原菌分布和耐藥性研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（22）：1739-1746.

[5] 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等. 2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志，2015，15（5）：401-410.

[6] 張冀霞，趙春江，劉文云，等. 替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌體外抗菌活性檢測(cè)的影響因素和方法學(xué)評(píng)估[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（7）：604-609.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing[S]．M2-A10，CLSI，2009.

[8] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[S]．M7-A8，CLSI，2009.

[9] 王輝. 對(duì)《替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程專家共識(shí)》一文的更正[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，38（8）：569.

[10] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S25，CLSI，2015.

[11] 李春輝. MDR、XDR、PDR多重耐藥菌暫行標(biāo)準(zhǔn)定義——國(guó)際專家建議[J]. 中國(guó)感染控制雜志，2014，13（1）：62-64.

[12] DENG M，ZHU M H，LI J J，et al. Molecular epidemiology and mechanisms of tigecycline resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii from a Chinese university hospital[J].Antimicrob Agents Chemother，2014，58（1）：297-303.

[13] SPANU T，DE ANGELIS G，CIPRIANI M，et al. In vivo emergence of tigecycline resistance in multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli[J]. Antimicrob Agents Chemother，2012 ，56（8）：4516-4518.

[14] 劉立榮，李向陽(yáng)，瞿玲娜，等. 替加環(huán)素對(duì)不同耐藥基因型耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的敏感性研究[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016 ，31（5）：383-386.