杜 琪 ，盛笑昱 ，楊 斌 ，王 羽中*，茅慧玲 *

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安 311300；2.浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310012）

斷奶是反芻動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中必須經(jīng)歷的一個(gè)階段，而早期斷奶是提高生產(chǎn)效率的技術(shù)手段之一。目前，犢牛斷奶的標(biāo)準(zhǔn)主要有3種：根據(jù)體重?cái)嗄蹋ㄕ?6.4%）；根據(jù)日齡斷奶（占43%）；根據(jù)干物質(zhì)采食量斷奶（占26.9%） ，此法較為推薦。大型品種犢牛當(dāng)連續(xù)3 d的干物質(zhì)采食量達(dá)到700～1 000 g時(shí)即可斷奶[1]。成功斷奶很大程度上依賴(lài)于斷奶前瘤胃的充分發(fā)育，因此，瘤胃發(fā)育狀況可作為合理的斷奶時(shí)間選擇標(biāo)準(zhǔn)之一。反芻動(dòng)物剛出生時(shí)主要依靠皺胃消化乳類(lèi)為主的日糧[2]，隨之向反芻轉(zhuǎn)變的過(guò)程需要瘤胃的不斷發(fā)育和相關(guān)微生物的定植，從而利用植物性飼料[3]。幼齡反芻動(dòng)物通過(guò)接觸植物性飼料，刺激胃腸道尤其是瘤胃的發(fā)育，促進(jìn)瘤胃微生物區(qū)系的建立[4]。Rey等[5]研究認(rèn)為，瘤胃微生物的定植過(guò)程迅速，且為相繼發(fā)生。然而，早期斷奶幼齡反芻動(dòng)物的瘤胃微生物定植規(guī)律尚未可知。因此，本研究以南方黃牛犢牛為試驗(yàn)對(duì)象，采用根據(jù)干物質(zhì)采食量斷奶的方法，利用高通量測(cè)序技術(shù)探討不同斷奶時(shí)間犢牛瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的差異，進(jìn)一步研究早期斷奶犢牛瘤胃微生物的定植規(guī)律，為幼齡反芻動(dòng)物實(shí)施早期斷奶技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取剛出生的健康無(wú)疾病的南方黃牛犢牛18頭，根據(jù)體重、出生日期相同或相近的原則，隨機(jī)分為4組，對(duì)照組3頭不早期斷奶（Normal Weaned，NW），早期斷奶組（Early weaned，EW）分為EW500組、EW750和EW1000組，每組5頭牛。NW組犢牛隨母牛一起生活，不飼喂開(kāi)食料及代乳粉，并于120日齡斷奶。3個(gè)早期斷奶組逐漸增加開(kāi)食料、青飼料的飼喂量，當(dāng)犢牛連續(xù) 3 d每日進(jìn)食固體飼料干物質(zhì)分別達(dá)500 g（EW500）、750 g（EW750）和1 000 g（EW1 000）時(shí)，停喂代乳粉。

EW組犢牛出生后4 h內(nèi)喝初乳，之后隨母自由進(jìn)食到6日齡。自7日齡起，每日飼喂乳液3 L，其中代乳粉1.5 L；14日齡起全部飼喂代乳粉，每日3 L直至斷奶。自10日齡起，開(kāi)食料和草料放在飼草中供犢牛自由采食。

各組犢牛斷奶后，于晨飼前利用口腔取樣裝置[6]通過(guò)犢牛口腔采取瘤胃內(nèi)容物。-80℃保存，用于提取DNA，測(cè)定瘤胃細(xì)菌的多樣性。

1.2 試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)日糧由代乳粉、開(kāi)食料組成（北京精準(zhǔn)牧業(yè)有限公司）。代乳粉營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1，開(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

表1 代乳粉的營(yíng)養(yǎng)成分

表2 0～3月?tīng)倥ｉ_(kāi)食料組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干物質(zhì)）

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 DNA提取 參照Gagen等[7]的珠磨法提取DNA。所有DNA樣品用Qubit2.0（Invitrogen）測(cè)定濃度。

1.3.2 細(xì)菌16S rRNA基因序列擴(kuò)增 16S rDNA基因序列擴(kuò)增采用519F/907R通用引物[8]：上游為5'-GCCTC CCTCGCGCCATCAG-3'；下游為5'-GCCTTGCCAGC CCGCTCAG-3'。為區(qū)分每個(gè)不同的樣本，在通用引物的上游序列中隨機(jī)添加8個(gè)核苷酸堿基的序列標(biāo)簽，即Barcoded-tag，形成Barcoded融合引物。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30循環(huán)；72℃延伸7 min[8]。

1.3.3 IlluminaMiSeq測(cè)序及下機(jī)數(shù)據(jù)分析 IlluminaMiSeq測(cè)序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

利用MOTHUR 軟件[9]中的trim.seqs語(yǔ)句將Barcode錯(cuò)配數(shù)≥1、引物錯(cuò)配數(shù)≥2、序列最短長(zhǎng)度＜200 bp、最大模糊堿基數(shù)≥1的下機(jī)數(shù)據(jù)去除，并用該語(yǔ)句去除Barcode和primer，除雜后的文件以FASTA序列文件保存。去雜后的數(shù)據(jù)與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)中的小核糖體RNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)后的序列利用MOTHUR軟件中的screen.seqs語(yǔ)句進(jìn)行二次去雜。利用MOTHUR軟件中的chimera.uchime語(yǔ)句去除嵌合序列。

利用 MOTHUR 軟件中的filter.seqs和cluster語(yǔ)句，以16S rRNA基因序列distance對(duì)去雜及去嵌合體后的序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)。利用RDP（Ribosomal Database Project）分類(lèi)器賦予每條序列物種單元分類(lèi)，物種分類(lèi)單元分為6層，依次為domain、phylum、class、order、family、genus。RDP分類(lèi)對(duì)genus的域值為0.8。

測(cè)序深度評(píng)估：利用MOTHUR軟件計(jì)算每個(gè)樣品在OTU=0.03水平下的稀疏曲線（Rarefaction Curve），用于評(píng)估不同樣本之間的豐度。

Alpha多樣性評(píng)估：利用MOTHUR軟件計(jì)算Chao、Shannon和Simpson指數(shù)。

Beta多樣性評(píng)估：利用在線軟件http://bioinforma tics.psb.ugent.be/webtools/Venn/繪 制 韋 恩（Venn）圖，用于顯示不同處理之間共有和特有的OTU情況；用jest和thetayc算法計(jì)算每個(gè)樣品在OTU=0.03水平下的群落結(jié)構(gòu)的相似度；通過(guò)計(jì)算所有處理間的生態(tài)距離，繪制主坐標(biāo)分析PCoA（Principal Coordinate Analysis）圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用Excel2010進(jìn)行整理，結(jié)果采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件的Duncan′s方差分析對(duì)各組進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

微生物各門(mén)屬和OUT需在每個(gè)處理組的至少3頭犢牛中出現(xiàn)（如果有組別少于或等于3頭，則需該組犢牛中都出現(xiàn)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性分析 4個(gè)處理組瘤胃內(nèi)容物中細(xì)菌的稀疏曲線見(jiàn)圖1，雖然沒(méi)有得到完全的平緩，但斜率在不斷減小，說(shuō)明趨向于飽和。

圖1 瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌16S rRNA基因序列的稀疏曲線

4個(gè)處理組的OTU覆蓋率均在95%以上（表3），能夠很好地反映樣品菌群情況。其中EW組的覆蓋率顯著高于NW組（P＜0.05），說(shuō)明EW組的飽和性好于NW組。NW組犢牛瘤胃內(nèi)容物的OTU數(shù)、Chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著高于EW組（P＜0.05），即NW組瘤胃內(nèi)細(xì)菌菌群豐度和多樣性高于EW組。

基于UniFrac的加權(quán)主坐標(biāo)分析其第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為20.35%和10.98%（圖2）。EW組的犢牛個(gè)體差異較為顯著，分布較為渙散，然而EW組和NW組分離較遠(yuǎn)，說(shuō)明早期斷奶會(huì)給瘤胃細(xì)菌分布造成差異。

圖2 瘤胃內(nèi)細(xì)菌結(jié)構(gòu)Unifrac加權(quán)主坐標(biāo)分析圖

圖3 不同斷奶時(shí)間犢牛瘤胃液中細(xì)菌群落共享和獨(dú)有的OTU的Venn分析

不同處理之間共有和特有的OTU 情況見(jiàn)圖3，4組共有OTU數(shù)為204個(gè)，NW組特有240個(gè)OTU，而EW組特有的OTU數(shù)較少，EW500、EW750和EW1000組特有的OTU數(shù)分別為59、72和83。

表3 97%相似性水平下物種豐富度和多樣性指數(shù)

2.2 物種分類(lèi) 由表4可知，瘤胃內(nèi)細(xì)菌主要?dú)w于厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變型菌門(mén)三大類(lèi)。本研究中相對(duì)含量大于0.1%的門(mén)共有7個(gè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，NW組瘤胃內(nèi)細(xì)菌最多的是厚壁菌門(mén)（53.9%），顯著高于EW750組和EW1000組（P＜0.05）；與NW組相比，EW組擬桿菌門(mén)相對(duì)較高，且在EW750組和EW1000組達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

由表5可知，在相對(duì)含量大于0.1%的菌屬中，各組中均以普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬和丁酸弧菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，且普雷沃氏菌占比例最多。EW組的普雷沃氏菌屬較NW組有所增加（P＞0.05）。NW組丁酸弧菌屬顯著低于EW500組（P＜0.05）。NW組分支桿菌屬和顫螺菌屬顯著高于EW組（P＜0.05）。EW組琥珀酸菌屬顯著高于NW組（P＜0.05）。纖維桿菌屬以EW750組最多（0.46%；P＜0.05）。各組間瘤胃球菌屬、月形單胞菌屬、梭菌屬和糞球菌屬相對(duì)含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期斷奶有利于提高犢牛的生長(zhǎng)性能，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，增加揮發(fā)性脂肪酸含量，降低氨態(tài)氮濃度，提高瘤胃內(nèi)源性酶活，改變瘤胃纖維降解菌的組成，且不同斷奶時(shí)間存在一定差異[10]。然而，瘤胃微生物大多為未培養(yǎng)微生物，依靠常用的熒光定量PCR技術(shù)并不能充分反映瘤胃細(xì)菌菌群的變化，只局限于一定豐度細(xì)菌或特定微生物，對(duì)未知微生物均未涉及。本試驗(yàn)應(yīng)用Illumina-MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，突破傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法，可以獲得大量測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)比對(duì)或聚類(lèi)分析，研究瘤胃微生物群落物種組成的變化，同時(shí)探尋一些低豐度或未知的細(xì)菌，能更加全面了解早期斷奶對(duì)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌菌群的影響以及不同斷奶時(shí)間造成的差異。

對(duì)于成年牛而言，瘤胃是一個(gè)非常重要的發(fā)酵場(chǎng)所，其中含有復(fù)雜的厭氧微生物，包括細(xì)菌、古菌、真菌、原蟲(chóng)和病毒。這些微生物可以利用飼料生產(chǎn)出揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮和微生物蛋白等；還可與宿主產(chǎn)生互作，影響宿主的健康、生產(chǎn)性能等[5]。然而，犢牛剛出生時(shí)瘤胃尚未發(fā)育，瘤胃內(nèi)處于無(wú)菌且無(wú)胚芽狀態(tài)，隨著日糧的攝入及外界環(huán)境中的微生物進(jìn)入瘤胃，逐漸形成復(fù)雜多樣的微生物區(qū)系[11]。大多數(shù)瘤胃細(xì)菌如蛋白分解菌、纖維素分解菌和其他種類(lèi)細(xì)菌在14日齡犢牛的瘤胃微生物區(qū)系中即可發(fā)現(xiàn)[12]。Jami等[13]認(rèn)為，瘤胃菌群同時(shí)受日糧和年齡的影響。本研究各組優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，與前人研究結(jié)果一致[14]。Thoetkiattikul等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高纖維（88%）和低淀粉（2%）飼糧的奶牛瘤胃內(nèi)擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)含量分別高達(dá)66.53%和24.98%。Rey等[5]對(duì)奶牛從出生至斷奶時(shí)期瘤胃菌群的定植進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)犢牛2日齡時(shí)瘤胃細(xì)菌主要包含變形菌門(mén)（70%）和擬桿菌門(mén)（14%），之后擬桿菌門(mén)隨日齡增長(zhǎng)逐漸取代變形菌門(mén)。厚壁菌門(mén)中多數(shù)為梭菌目，具有纖維消化作用。本研究結(jié)果顯示，EW組的厚壁菌門(mén)較NW組少，可能原因是與NW組未采食開(kāi)食料相比，EW組10日齡即開(kāi)始采食開(kāi)食料，飼糧的攝入改變了菌群組成。

表4 相對(duì)含量大于0.1%（序列占測(cè)序總量比例）的菌門(mén)

表5 相對(duì)含量大于0.1%（序列占測(cè)序總量比例）的菌屬

奶牛瘤胃中普雷沃氏菌屬、丁酸菌屬、纖維桿菌屬和密螺旋體屬等為優(yōu)勢(shì)菌屬[16]，與本研究的結(jié)果有所差異，這可能是試驗(yàn)動(dòng)物不同所造成。Wood等[17]利用純培養(yǎng)的方法分離出普雷沃氏菌屬，分析能夠占到瘤胃細(xì)菌的60%，它擁有高活性的半纖維分解菌[18]，可以降解植物非纖維多糖和蛋白質(zhì)[19]。Rey等[5]研究認(rèn)為，在15～83日齡，隨著固體飼料的攝入，普雷沃氏菌屬占有主導(dǎo)地位。利用454焦磷酸測(cè)序及分類(lèi)學(xué)分析鹿[20]和成年奶牛[13]瘤胃菌群，結(jié)果也顯示普雷沃氏菌屬是優(yōu)勢(shì)菌屬。本研究結(jié)果與這些報(bào)道較為一致，與NW組相比，EW組犢牛瘤胃中普雷沃氏菌屬增多。這些結(jié)果說(shuō)明犢牛越早采食固體飼料，其瘤胃菌群越接近于成年牛。丁酸弧菌屬是瘤胃中主要的產(chǎn)丁酸菌，同樣也是主要的半纖維素降解菌[21]，琥珀酸菌屬雖然不能發(fā)酵碳水化合物和氨基酸，但能將琥珀酸鹽轉(zhuǎn)化為丙酸[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，EW500組的丁酸弧菌屬和琥珀酸菌屬較NW組均顯著增加，該兩菌屬的變化與瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸丁酸和丙酸含量的結(jié)果一致[10]。揮發(fā)性脂肪酸是經(jīng)由瘤胃上皮代謝的，它對(duì)瘤胃容積和瘤胃乳頭的發(fā)育有刺激作用，能夠促進(jìn)瘤胃的發(fā)育[23]。由此可見(jiàn)，與傳統(tǒng)飼喂相比，盡早接觸固體飼料可以使?fàn)倥Ａ鑫冈跀嗄糖熬偷玫捷^好的發(fā)育，為斷奶后的健康生長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)。Li等[24]首次在瘤胃上皮發(fā)現(xiàn)分支桿菌屬的定植，并認(rèn)為該菌屬?zèng)]有發(fā)酵飼料的功能。此外，有研究報(bào)道在動(dòng)物飼喂高精料日糧時(shí)分支桿菌屬對(duì)瘤胃上皮的健康有負(fù)面影響[25]。本試驗(yàn)中分支桿菌屬在EW組顯著降低，其原因有待進(jìn)一步探究。

然而，本研究發(fā)現(xiàn)早期斷奶3個(gè)組間瘤胃微生物變化并不明顯，可能原因是這3個(gè)組同時(shí)采食固體飼料，且飼料組成相同。

4 結(jié) 論

早期斷奶可以改變犢牛的瘤胃細(xì)菌多樣性和物種豐度，丁酸弧菌屬、琥珀酸菌屬、纖維桿菌屬增加，分支桿菌屬降低，而3個(gè)早期斷奶組間差異并不顯著。從瘤胃微生物角度考慮，推薦在犢牛連續(xù)3 d每日進(jìn)食固體飼料干物質(zhì)達(dá)500 g時(shí)斷奶。

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