修 朋，曲揚華，高月鋒，刁志成，羅海玲

（動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193）

維生素E又稱生育酚，是一種與繁殖密切相關的脂溶性維生素，維生素E作用于公畜、母畜及胎兒調(diào)控繁殖[1-3]，對雄性繁殖主要影響性器官的發(fā)育以及精液品質(zhì)。維生素E通過抗氧化作用調(diào)節(jié)激素合成及分泌、生殖相關酶活性和基因表達量，改善動物的繁殖性能。

睪酮是一種重要的雄激素，本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素E有提高綿羊睪酮合成相關蛋白GATA-4 和CYP11A1表達量的趨勢，并且顯著提高了睪酮合成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）的表達量[4]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂維生素E對羔羊血清睪酮濃度無顯著影響[5]。睪酮合成是一個復雜的過程，雄性動物體內(nèi)大部分睪酮由睪丸間質(zhì)細胞分泌[6]。動物體內(nèi)的睪酮合成存在基礎分泌和下丘腦-垂體-睪丸軸誘導2種形式[7]，后者主要受促黃體生成素（LH）刺激。動物體內(nèi)的睪酮分泌受到內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、旁分泌調(diào)節(jié)和自分泌調(diào)節(jié)[7]。睪酮合成與調(diào)節(jié)過程受體內(nèi)外多種因素如激素分泌、睪丸內(nèi)其他細胞及其分泌的細胞因子的作用[8]，因此難以探究維生素E對于睪丸間質(zhì)細胞的睪酮合成作用。本研究以綿羊原代睪丸間質(zhì)細胞為試驗材料，從細胞水平探究維生素E對睪丸間質(zhì)細胞睪酮基礎分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集 選擇健康無病、體況良好的2月齡小尾寒羊（♀）×杜泊（♂）雜交公羔（購自北京市昌平區(qū)金燕都綠葉農(nóng)場），屠宰后分離兩側睪丸組織，用于睪丸間質(zhì)細胞分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（康源生物）、臺盼藍染液（索萊寶）、RIPA組織/細胞裂解液（Coolaber）、CCK-8試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）、水溶性維生素E、DMEM/F12培養(yǎng)液、PBS、0.25%胰蛋白酶購自Hyclone，氯化硝基四氮唑藍（NBT）、輔酶ⅠNAD購自上海生工，二甲基亞砜（DMSO）、脫氫表雄酮（DHEA）、一型膠原酶購自Sigma，綿羊 3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）、17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD）、17α-羥化酶（CYP17）、膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）、睪酮ELISA檢測試劑盒購自北京冬歌生物，動物細胞RNA提取試劑盒、Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（去基因組）、Super Real 熒光定量預混試劑增強版，均購自天根生物。手術器械（眼科剪、眼科鑷）、血細胞計數(shù)板、離心機、酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱、細胞搖床、超凈工作臺、電子天平、恒溫浴鍋、熒光定量基因擴增儀。

1.3 睪丸間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng) 用無菌PBS清洗至無血污，在75%酒精內(nèi)浸泡30 s消毒，再用PBS清洗3～4次。用眼科剪及鑷子剝除睪丸表面被膜，取1 cm3左右小塊置于裝有2 mL 0.25% I型膠原酶的離心管內(nèi)，封口后置于搖床內(nèi)，37℃，100 r/min，震蕩12 min。取出后加入與酶等量的含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，靜置5 min，用200目與400目組合細胞篩進行過濾。收集濾液于離心管內(nèi)，1 200 r/min離心5 min，細胞位于離心管底部，用無菌PBS清洗3次。加入含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基獲得細胞懸液。然后將細胞懸液接種于適當培養(yǎng)皿內(nèi)，觀察細胞形態(tài)，根據(jù)試驗需要進行相應的處理。

1.4 睪丸間質(zhì)細胞的活率鑒定 細胞懸液稀釋至適宜濃度，取適量細胞懸液加入等量的0.4%臺盼藍染液，混勻后吸取10 μL，從計數(shù)板上蓋玻片的一側加樣，置于顯微鏡下計數(shù)，活細胞會呈無色透明狀，死細胞被染成藍色，記錄其中的活細胞和死細胞數(shù)。

1.5 綿羊睪丸間質(zhì)細胞純度鑒定 由于3β-HSD在睪丸內(nèi)特異性的存在于間質(zhì)細胞內(nèi)，間質(zhì)細胞的鑒定采用3β-HSD染色法進行，A染液配方：NBT 1 mg，DHEA 0.6 mg，溶于0.6 mL DMSO內(nèi)；B染液配方：NAD 10 mg溶于9.5 mL PBS內(nèi)。調(diào)整細胞濃度，將細胞接種于48孔板內(nèi)，每孔0.25 mL（3×105個細胞），培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，每孔加入200 μL 3β-HSD染色液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h左右，間質(zhì)細胞被染成藍色，計算間質(zhì)細胞純度。

1.6 維生素E處理與睪酮含量測定 將分離收集的睪丸間質(zhì)細胞接種于6 cm皿內(nèi)，細胞濃度調(diào)整為106個/mL，培養(yǎng)液為含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。試驗設計為 4個維生素 E處理（0、40、80、160 μg/mL），每個濃度3個復孔，每個培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基含量為5 mL。37℃，5%CO2，培養(yǎng)48 h。48 h后更換含有不同濃度維生素E（0、40、80、160 μg/mL）的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基上清測定睪酮含量。睪酮含量的測定用綿羊睪酮ELISA試劑盒，試驗重復3次，具體操作方法參考說明書。

1.7 睪酮合成相關酶含量測定 將1.6中收集完培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿用PBS清洗，加入350 μL細胞裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。充分裂解后，12 000×g離心5 min，取上清，用ELISA試劑盒測定睪酮合成相關酶（P450scc、3β-HSD、17β-HSD、CYP17）的含量。1.8 睪酮合成關鍵基因表達水平檢測 細胞分離培養(yǎng)方法同1.3，培養(yǎng)48 h后更換含有不同濃度維生素E（0、40、80、160 μg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后收集細胞并提取細胞總RNA，測定RNA濃度，調(diào)整至每個反應管內(nèi)2 μg RNA。去除總RNA內(nèi)的基因組DNA后，進行反轉(zhuǎn)錄，將cDNA稀釋1倍后進行熒光定量。以18S與GAPDH作為內(nèi)參，熒光定量目的基因為3β-HSD、17β-HSD、P450scc、CYP17、StAR。 引物序列見表1。

表1 熒光定量引物序列

1.9 統(tǒng)計分析 對于睪酮含量以及酶含量測定的試驗，采用Logistics曲線（4參數(shù)）來擬合不同濃度標準品的OD值，以OD值為橫坐標，睪酮濃度以及酶含量為縱坐標，計算出標準曲線的方程式，通過此方程式，結合樣品的OD值，計算出各個樣品的睪酮濃度以及酶含量。將獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用Duncan′s法，結果用平均值±標準誤表示。對于熒光定量基因，以得到的CT值為統(tǒng)計參數(shù)，按2-△△CT法，算出相對表達量。以相對表達量的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用SPSS19.0軟件進行分析，采用單因素方差分析法，多重比較采用Duncan′s法，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準，以0.05≤P＜0.10為有差異顯著趨勢。

2 結 果

2.1 睪丸間質(zhì)活率、純度及形態(tài)觀察 分離得到的細胞，用臺盼藍進行染色，活的細胞呈無色透明泡狀，死細胞則被染成藍色，經(jīng)計算細胞活率達96%。如圖1所示，采用3β-HSD特異染色，睪丸間質(zhì)細胞被染成藍色，細胞純度達95%以上。如圖2所示，接種后4 h左右，睪丸間質(zhì)細胞開始貼壁，鋪展在細胞培養(yǎng)皿的底部。培養(yǎng)24 h后，大部分細胞貼壁，貼壁細胞間連結成網(wǎng)狀（圖3）。繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，細胞能夠增殖，細胞數(shù)量增多，密度變大，可以傳代培養(yǎng)。

圖1 綿羊睪丸間質(zhì)細胞純度鑒定結果（10×40）

圖2 接種4 h后綿羊睪丸間質(zhì)細胞貼壁情況（10×10）

2.2 維生素E對睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌的影響 如圖4所示，添加40 μg/mL維生素E睪酮濃度有增加的趨勢（P=0.061），其余濃度均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 接種24 h后綿羊睪丸間質(zhì)細胞貼壁情況（10×10）

圖4 維生素E對綿羊睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌的影響

2.3 維生素E對睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成相關酶含量的影響 如表2所示，添加維生素E顯著影響綿羊睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)睪酮合成酶3β-HSD和P450scc的含量（P＜0.05），其中 40 μg/mL處理組 3β-HSD含量較對照組顯著升高（P＜0.05），同時P450scc含量顯著高于對照組和160 μg/mL維生素E組（P＜0.05），而其余各組間未見有顯著差異（P＞0.05）；此外，維生素E的添加有提高間質(zhì)細胞17β-HSD（P=0.084）和CYP17α（P=0.071）酶含量的趨勢，其中以40 μg/mL處理組效果最高。二次項分析顯示，4種酶差異顯著（P＜0.05），其中P450scc酶差異極顯著（P＜0.01），隨維生素E添加，酶含量呈先上升后下降的趨勢。

2.4 維生素E對睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成關鍵基因表達水平的影響 如圖5所示，添加維生素E可顯著影響綿羊睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)睪酮合成3β-HSD和P450scc基因相對表達量（P＜0.05），其中 40 μg/mL處理組3β-HSD活性較對照組顯著升高，而其余各組間未見顯著差異（P＞0.05）；添加40 μg/mL維生素E有提高間質(zhì)細胞17β-HSD基因表達的趨勢（P=0.067），添加40 μg/mL和80 μg/mL維生素E 組StARmRNA相對表達量有增加趨勢（P=0.063，P=0.07），而維生素E對CYP17mRNA 相對表達量無顯著影響（P＞0.05）。

表2 不同維生素E添加對綿羊睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)睪酮合成相關酶含量的影響

圖5 維生素E對綿羊睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成相關基因相對表達的影響

3 討 論

3.1 綿羊原代睪丸間質(zhì)細胞分離 睪丸間質(zhì)細胞存在于睪丸曲細精管間的結締組織內(nèi)，本試驗利用睪丸間質(zhì)細胞的位置特性，避免破壞曲細精管，將曲細精管間的間質(zhì)細胞消化震蕩為單細胞，獲得的細胞活率達96%以上，細胞純度達95%以上，較簡單的機械分離法[20]及酶消化法[21]，有效減少了對原代細胞的損傷，分離的細胞能夠貼壁生長，并穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

3.2 維生素E對綿羊原代睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成影響缺乏維生素E影響睪丸發(fā)育，造成血清中總睪酮濃度降低[9]。日糧中添加維生素E可以緩解應激造成的異常睪酮分泌[10]，與本試驗結果一致，添加40 μg/mL維生素E有促進睪酮合成的趨勢。

3.3 維生素E對睪酮合成關鍵酶及基因表達的影響 底物膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜是類固醇激素合成的限速步驟，StAR介導膽固醇的跨膜轉(zhuǎn)運。在睪丸間質(zhì)細胞中，StAR表達主要由LH介導的cAMP依賴性通路的激活調(diào)控，導致轉(zhuǎn)錄激活[11]。StARmRNA表達降低會干擾睪酮合成，導致睪丸內(nèi)睪酮水平降低[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊日糧中添加維生素E顯著提高了StAR的表達[4]。缺氧造成的氧化劑增多會導致睪丸中StAR的表達下降[13]。而當睪丸間質(zhì)細胞應激情況下，添加維生素E可以抑制應激對睪酮的影響，同時對StAR蛋白表達抑制有顯著作用[10]。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加40、80 μg/mL維生素E對綿羊睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)StARmRNA表達有提高趨勢，可能是由于維生素E通過抗氧化途徑，提高StAR的表達，促進膽固醇的轉(zhuǎn)運。

睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)有較高的P450scc表達水平，P450scc是膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮的關鍵因子[12]。研究發(fā)現(xiàn)，化學試劑會影響P450scc含量，進而影響睪酮合成；P450sccmRNA水平下降也會造成睪酮合成下降[14]。但與StAR不同，P450scc在合成的早期階段不受激素的調(diào)節(jié)[12]。在沒有LH的刺激下P450scc仍維持一定的表達水平[15]。本試驗中，添加40 μg/mL維生素E顯著提高了P450scc酶的含量與基因表達量。推測其酶含量的提高可能是由于維生素E直接作用于P450scc，調(diào)節(jié)酶的含量，提高酶活性；也可能是由于P450sccmRNA表達量的提高，增加了膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮。

3β-HSD催化孕烯醇酮為孕酮，在睪丸間質(zhì)細胞中表達，是特異性的間質(zhì)細胞鑒定指標，其活性可衡量間質(zhì)細胞合成睪酮的能力[16]。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射多氯聯(lián)苯造成小鼠3β-HSDmRNA表達下降，添加維生素E能夠顯著恢復3β-HSDmRNA表達[17]。本試驗中添加適量（40 μg/mL）維生素E 顯著提高3β-HSD酶含量與基因表達，加速孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮。

孕酮在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成后在CYP17作用下形成雄烯二酮，CYP17的合成需要LH或cAMP的刺激，在無激素刺激的情況下，CYP17的合成會停止[15,18]。此外，在睪酮的介導下，CYP17與自由基結合成復合物，增加了CYP17酶的分解，使其活性降低[18]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，添加維生素E對于CYP17酶含量與基因表達均無顯著影響，可能是缺少相應的激素刺激，CYP17合成終止，但添加40 μg/mL維生素E組 CYP17酶含量有增加的趨勢，可能是由于維生素E清除自由基的作用，促進雄烯二酮的形成。

睪酮生物合成的最后一步是17β-HSD 催化雄烯二酮還原為睪酮[15]，17β-HSD主要在睪丸中表達。線粒體釋放的活性氧刺激CYP17、3β-HSD和17β-HSD的活性，從而刺激睪酮的合成[19]。本試驗中40 μg/mL維生素E組 17β-HSD的含量有提高趨勢，可以刺激睪酮的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，由于腹腔注射多氯聯(lián)苯造成的小鼠17β-HSDmRNA表達的下降，對其施加一定劑量的維生素E能夠顯著恢復17β-HSDmRNA表達[17]。可知維生素E對于睪酮合成中關鍵酶的mRNA表達有提高作用。本研究發(fā)現(xiàn)，40 μg/mL維生素E組 17β-HSDmRNA表達有增加趨勢，提高雄烯二酮還原為睪酮的速率。

4 結 論

維生素E通過提高P450scc和3β-HSD基因表達和酶活含量，影響CYP17酶含量與StAR基因表達，從而調(diào)控睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成。綜合本試驗各指標，以40 μg/mL維生素E添加量效果較優(yōu)。

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