范麗君, 盧文玉, 唐玉蘭, 黃 帆, 李一鋒, 盧珍梅, 韋俊杰, 鄭明華

中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)等疾病的致病機制之一是血腦屏障(blood brain barrier,BBB)完整性受到破壞,在其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中已證實是由CD4+T淋巴細胞透過BBB滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)實質(zhì)介導(dǎo)的自身免疫性炎癥反應(yīng)所致[1]。

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)在CNS炎癥相關(guān)疾病過程中參與BBB通透性的調(diào)節(jié),ApoE基因敲除小鼠CNS炎癥因子增加且與BBB通透性改變有關(guān)。我們已發(fā)現(xiàn),ApoE的缺乏會上調(diào)炎癥因子的表達,ApoE擬肽可以抑制該效應(yīng),從而減少BBB的破壞[2]。而淋巴細胞分泌的TNF-α等炎癥因子可以調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達[3],進而影響B(tài)BB滲透性。因此,我們推測,ApoE可能影響外周淋巴細胞等免疫細胞的炎癥因子的分泌,并調(diào)節(jié)MMP-9的表達,最終影響B(tài)BB滲透性。目前諸多研究均集中在動物實驗中進行,在體外細胞層面的相關(guān)研究少有報道。

已證實EAE小鼠外周免疫激活先于中樞的病理學(xué)改變[4],因此,我們通過免疫原啟動小鼠外周免疫過程,在體外單獨研究ApoE對脾臟淋巴細胞分泌炎癥因子及MMP-9的影響,這也更好的排除了神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)揮的中樞固有免疫炎癥作用的干擾,以便更深入了解ApoE在CNS炎癥相關(guān)疾病中對BBB影響的病理機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠,體重17～20 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[動物許可證號SCXK(京)2009-0004],飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的SPF級動物房。

1.1.2 實驗試劑 MOG35- 55(序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)購于上海生工生物工程有限公司,純度>95%。百日咳毒素(PTX)和完全弗氏佐劑(CFA)購于美國Sigma公司；熱滅活結(jié)核菌素(H37Ra)購于美國BD公司；小鼠TNF-α、IL-17、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素(雙抗)購自美國Gibco公司；D-Hanks液購自武漢博士德生物公司；臺盼藍、紅細胞裂解液購自索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫誘導(dǎo) 用0.01 mol/L的PBS緩沖溶液將少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG35- 55)稀釋至2 mg/ml,與等量的含4 mg/ml熱滅活結(jié)核菌素(H37Ra)的完全弗氏佐劑充分混勻,在冰上使用全玻璃注射器抽打制備油包水乳劑抗原。在小鼠背部皮下多點注射MOG35-55乳劑抗原(0.2 ml/只)。免疫當天、免疫后48 h給每只小鼠腹腔各注射一次百日咳毒素200 ng。

1.2.2 脾臟淋巴細胞分離培養(yǎng)(參考Ping Kuang[5]等方法)及干預(yù) 免疫后第7天頸椎脫臼法處死小鼠,75%酒精消毒后,無菌條件下分別取ApoE-/-小鼠及WT小鼠脾臟,充分剔除筋膜及脂肪組織,予以無菌D-Hanks清洗兩遍,超凈臺內(nèi)置于200目篩網(wǎng),用5 ml注射器針芯輕輕均勻研磨,用適量無菌D-Hanks沖洗過濾,取濾液至15 ml離心管,1000 rpm/min離心5 min洗滌兩次,去上清,加入紅細胞裂解液(10 ml/只)于冰上裂解10 min除去紅細胞,1000 rpm/min離心5 min洗滌兩次,去上清,加入含胎牛血清和雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基輕輕均勻吹打制備細胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶,于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱凈置24 h,以除去貼壁的巨噬細胞,收集未貼壁的細胞懸液即得到脾臟淋巴細胞。用臺盼藍染色,活細胞數(shù)大于95%后調(diào)整密度為1×106/ml備用。隨機分為4組,即ApoE-/- 實驗組(E-ApoE-/-)、WT實驗組(E-WT)、ApoE-/-對照組(C-ApoE-/-)、WT對照組(C-WT)。兩實驗組(E-ApoE-/-、E-WT)給予濃度為25 μg/ml的MOG35-55刺激淋巴細胞,兩對照組(C-ApoE-/-、C-WT)細胞給予等量生理鹽水作為對照處理,24 h后離心收集上清液。

1.2.3 炎癥因子及基質(zhì)金屬蛋白酶檢測 取各組細胞上一步中收集的上清液各100 μl微升分別加入到TNF-α、IL-17、MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒,測定各組淋巴細胞TNF-α、IL-17、MMP-9、TIMP-1的濃度,分析各組的表達差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組脾臟淋巴細胞TNF-α、IL-17表達情況比較 與C-WT組比較,C-ApoE-/-組淋巴細胞TNF-α、IL-17的濃度升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；分別與對照組相比,E-ApoE-/-組和E-WT組淋巴細胞TNF-α、IL-17濃度均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與E-WT組相比,E-ApoE-/-組TNF-α、IL-17的濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖1A、B)。

2.2 各組脾臟淋巴細胞MMP-9表達情況比較 C-ApoE-/-組淋巴細胞MMP-9的濃度較C-WT組的濃度升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E-ApoE-/-組和E-WT組淋巴細胞MMP-9濃度分別與對照組相比,其濃度均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與E-WT組相比,E-ApoE-/-組MMP-9濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

2.3 各組脾臟淋巴細胞TIMP-1表達情況比較 經(jīng)兩兩比較,各組小鼠淋巴細胞TIMP-1濃度未見明顯差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

ApoE-/-：載脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TNF-α：腫瘤壞死因子-alpha；IL-17：白細胞介素-17

與E-WT組相比*P<0.05；與C-ApoE-/-組相比!P<0.05；與C-WT組相比#P<0.05

圖1 各組脾臟淋巴細胞培養(yǎng)液TNF-α(圖1A)、IL-17(圖1B)濃度的比較

ApoE-/-：載脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；MMP-9：matrix metalloproteinase-9

與E-WT組相比*P<0.05；與C-ApoE-/-組相比!P<0.05；與C-WT組相比#P<0.05

圖2 各組脾臟淋巴細胞培養(yǎng)液MMP-9濃度的比較

ApoE-/-：載脂蛋白E基因敲除型；WT：野生型；TIMP-1：tissueinhibitor of metalloproteinases 1

E-ApoE-/-組、E-WT組、C-ApoE-/-組、C-WT組脾臟淋巴細胞分泌TIMP-1的濃度未見明顯改變(P>0.05)

圖3 各組脾臟淋巴細胞培養(yǎng)液TIMP-1濃度的比較

3 討 論

ApoE是CNS中主要的載脂蛋白,在中樞內(nèi)具有轉(zhuǎn)運脂質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)、調(diào)節(jié)炎癥、調(diào)節(jié)免疫等多重生物學(xué)作用。動物研究已證實ApoE可以保護EAE小鼠的血腦屏障[6,7]。本研究發(fā)現(xiàn),免疫誘導(dǎo)小鼠后,ApoE-/-小鼠和WT小鼠脾臟淋巴細胞均能分泌炎癥因子TNF-α、IL-17；體外用MOG35-55刺激脾臟淋巴細胞后,E-ApoE-/-和E-WT組淋巴細胞炎癥因子濃度均升高,且E-ApoE-/-組較E-WT組炎癥因子濃度更高,這些說明,單獨刺激脾臟淋巴細胞導(dǎo)致炎癥因子分泌增加,這可能是發(fā)生促炎癥反應(yīng)過程的關(guān)鍵,并且ApoE的缺乏可以加重炎癥反應(yīng)過程,放大炎癥級聯(lián)效應(yīng)。這可能從兩方面來解釋：一方面,ApoE擬肽抑制CD4+T淋巴細胞的增殖[8]。由于缺乏ApoE使其對淋巴細胞增殖的抑制作用解除或減弱,因而ApoE-/-小鼠淋巴細胞大量增殖后炎癥因子表達增加更明顯。另一方面,ApoE-/-小鼠外周淋巴細胞亞群Th1(主要分泌TNF、IFN-γ)、Th17(主要分泌IL-17、IL-22)分化的比例較其他亞群明顯增加[2,9,10]并介導(dǎo)EAE等炎性脫髓鞘疾病過程[11]。因此,ApoE-/-小鼠的Th1/Th17淋巴細胞亞群比例增加最終亦導(dǎo)致其炎癥因子分泌增加較為明顯,進一步加重炎癥反應(yīng),從而放大炎癥級聯(lián)效應(yīng)并破壞中樞實質(zhì)。最近一項動物實驗發(fā)現(xiàn),ApoE擬肽顯著抑制MMP-9的炎癥激活因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β等),從而降低對BBB的降解[12]。另外,在體外BBB模型實驗中,予以TNF-α刺激5 h后BBB滲透性即明顯增加,且Rho/Rho激酶信號通路參與TNF-α誘導(dǎo)的BBB通透性的調(diào)節(jié)[13]。與動物實驗研究相比,本實驗在體外單獨對脾臟淋巴細胞研究發(fā)現(xiàn),ApoE可以減少脾臟淋巴細胞炎癥因子分泌而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),再結(jié)合諸研究結(jié)果,該過程可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α、IL-17等相關(guān)的Rho/Rho激酶信號通路來調(diào)控MMP-9,最終影響B(tài)BB滲透性。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是BBB破壞的啟動因素,其中MMP-9是分解BBB重要基質(zhì)成分的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn),免疫誘導(dǎo)小鼠后,ApoE-/-小鼠和WT小鼠的淋巴細胞均能分泌MMP-9,且ApoE-/-小鼠較明顯；MOG35-55在體外刺激脾臟淋巴細胞后,E-ApoE-/-組、E-WT組淋巴細胞MMP-9濃度均明顯高于對照組,且E-ApoE-/-組MMP-9濃度較E-WT組更高。說明刺激淋巴細胞可以分泌MMP-9,這將導(dǎo)致BBB基質(zhì)成分被分解而使BBB完整性破壞,且ApoE的缺乏將導(dǎo)致淋巴細胞MMP-9分泌增加而使BBB破壞更加嚴重。雖然在小鼠體內(nèi)已證實缺乏ApoE導(dǎo)致EAE小鼠MMP-9的表達及活性增加[7]，使BBB破壞,但細胞層面的機制尚未明了。我們通過體外淋巴細胞的研究發(fā)現(xiàn),ApoE可能抑制了EAE的淋巴細胞MMP-9的分泌,從而發(fā)揮保護BBB的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn),EAE和MS疾病中TNF-α、IL-1β、IL-17等炎癥因子可以誘導(dǎo)MMP-9的表達；炎癥因子主要通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)通路來對MMP-9進行調(diào)控[3]。最近一項研究還發(fā)現(xiàn)ApoE異構(gòu)體ApoE4可能會增加NF-κB/MMP-9通路的激活,加劇BBB破壞[14]。因此推測,ApoE可能也通過炎癥因子TNF-α、IL-17相關(guān)的MAPKs、NF-κB通路來調(diào)節(jié)MMP-9的表達,從而影響B(tài)BB。

TIMP-1結(jié)合活化態(tài)MMP-9并抑制后者的活性,MMP-9/TIMP-1二者結(jié)合與BBB完整性密切相關(guān),但TIMP-1在MS表現(xiàn)為小幅度地減少或者無變化[15],因此,當TIMP-1無明顯變化時,升高的MMP-9將發(fā)揮破壞BBB的作用[16]。我們在體外刺激脾臟淋巴細胞并未發(fā)現(xiàn)各組TIMP-1濃度變化的差異,說明了ApoE可能不影響TIMP-1的表達或影響幅度很小,而最終這些升高的MMP-9由于未能被足夠的TIMP-1結(jié)合而分解BBB基質(zhì)使其結(jié)構(gòu)破壞。我們的體外細胞實驗與小鼠的TIMP-1濃度無明顯改變的實驗結(jié)果[7,17]是一致的。

目前,神經(jīng)膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的中樞固有免疫性炎癥反應(yīng)對BBB的影響以及ApoE參與其中的調(diào)節(jié)作用已逐漸被報道[17～19],而與諸多研究不同的是,我們通過敲除小鼠ApoE基因,并在體外排除了動物實驗中關(guān)于中樞固有免疫細胞(主要是膠質(zhì)細胞)的炎癥損傷作用的影響,獨立探索了ApoE對脾臟淋巴細胞的影響,這對闡明ApoE通過調(diào)節(jié)外周免疫性炎癥因子及MMP-9對BBB產(chǎn)生影響是有重要意義的。盡管如此,但我們也還需要進一步在體外的獨立環(huán)境中對淋巴細胞亞群在這方面的作用進行探究,尤其是體外細胞研究層面探究Th1/Th17亞型的具體作用情況。

通過我們在體外單獨對淋巴細胞的研究表明,ApoE可以調(diào)節(jié)EAE抗原刺激的脾臟淋巴細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-17和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9。再結(jié)合相關(guān)研究報道,ApoE可能通過影響炎癥因子TNF-α、IL-17相關(guān)的MAPK、NF-κB、Rho/Rho激酶信號通路等多條途徑來調(diào)節(jié)MMP-9的表達,進而影響B(tài)BB的完整性。但是,其涉及的具體作用仍不完全明確,因此還亟待進一步探究,以期發(fā)現(xiàn)ApoE在CNS自身免疫性炎癥疾病中對BBB影響的確切機制。

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