許婷婷 ，王躍嗣

（1.濰坊護理職業(yè)學院，山東 青州 262500；2.濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心，山東 煙臺 264003）

隨著社會老齡化進程的加劇，各種神經退行性疾病的發(fā)病人數也逐年增加。神經退行性疾病和神經系統損傷（如腦缺血、腦中風、脊髓損傷等）嚴重威脅著人類的身體健康。帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風等均是由于分化成熟的神經細胞受到損傷不能分裂增殖以彌補損傷或死亡細胞所造成的，因此尋找新的神經元細胞對治療神經退行性疾病具有重要意義。雖然胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell，ESC）、誘導多能性干細胞（induced Pluripotent Stem Ccell，iPSC）能夠在體外分化形成神經細胞，但其應用于臨床前受到分化效率低、易形成腫瘤危害等限制。自2006年Takahashi等[1]發(fā)現細胞重編程技術以來，細胞重編程技術越來越受到國內外學者的青睞。將體細胞作為靶細胞，重編程形成神經細胞，使治療神經系統疾病成為可能。

1 細胞重編程

把體細胞重編程為iPSC是一項具有革命性的技術[2]。2006年 Takahashi和 Yamanaka[1]第一次把 Oct4、Sox2、Klf和 c-Myc 4個轉錄因子通過逆轉錄病毒轉染方式在小鼠成纖維細胞上過表達形成iPSC，這些細胞與小鼠ESC具有相似的生長特性和形態(tài)。因為c-Myc是原癌基因，形成的iPSC具有癌變可能，自從iPSC產生以來就存在癌變的潛在危險，如果無法解決癌變可能，iPSC就無法在臨床上應用。因此，研究人員開展了多種替代研究，企圖實現同時具有iPSC功能，又不具有癌變潛能的新的重編程分子。后來研究人員又整合了包括Nanog、Esrrb、Nr5a2等多種不同基因重編程為成纖維細胞和其他不同類型的體細胞，但是Oct4卻不能被其他因子所替代，這表明在細胞重編程中它起到特定的作用。

2 miRNA參與細胞重編程

為提高細胞重編程的效率，研究人員試用了各種不同的小分子和特定的miRNA。在細胞重編程轉染Oct4、Klf4和Sox2（OKS）的同時，想用miRNA替代c-Myc，結果發(fā)現[3]，瞬時轉染miR-291-3p、miR-294或miR-295可以形成iPSC，且能增加iPSC形成數目。跟c-Myc不同，在去分化的早期階段，miR-294不會誘導小鼠成纖維細胞增殖，與外源性的c-Myc相比，miR-294能產生同源的iPSC克隆。

目前已有研究表明[4-5]，只用miRNA就可以誘導細胞發(fā)揮多能性。在沒有轉錄因子的情況下，只用逆轉錄病毒過表達miR-302/367能誘導小鼠和人的成纖維細胞形成iPSCs[4]，這些細胞注入囊胚后可形成畸胎瘤，并且過度表達miR-302/367能加速細胞重編程，提高編程效率，但在不表達miR-367的條件下，培養(yǎng)3周后仍然沒有獲得iPSCs的克隆，這就暗示miR-302/367介導的重編程中需要有miR-367的表達。實驗發(fā)現[5]，瞬時轉染miR-200c、miR-302和miR-367這一組合可以重編程小鼠和人的體細胞。盡管到目前為止，miRNA介導的重編程還沒被廣泛用于實驗，但是研究人員已經開始重視miRNA的作用。用經典的四因子重編程小鼠成纖維細胞時，加入miR-302家族和miR-290家族能輕微提高細胞重編程效率，但在沒有其他轉錄因子的情況下，這兩個家族的miRNA不能完成誘導。

另一研究[6]表明了miRNA在細胞重編程中的重要作用，成纖維細胞在缺失所有成熟miRNA的情況下不能形成iPSCs。因此，miRNA不僅在多能細胞的分化中是必須的，還在纖維細胞的去分化過程中起著重要作用。

在細胞重編程的最初階段，許多miRNA家族被認定為上皮-間充質之間轉化（MET）的介質，而MET存在于體細胞重編程的起始階段。其中，研究較詳細的是miR-205和miR-200家族，它們都是由BMP誘導而成，并且參與維持細胞的多能性。miR-200家族可以通過抑制E-cadherin的抑制因子Zeb1和Zeb2，還有Snail和Slug來促進MET[7]。除了miR-200家族，還有許多其他的miRNA家族能夠提高細胞重編程效率。表達分析在mESCs重編程起始階段中高表達的miRNA家族，顯示在重編程的前 4 天，miR-17/92、miR-106b/25、miR-106a/363 和miR-302b/367會有表達[8]。通過促進MET，miR-106b/25家族能增強iPSC的誘導。轉染miR-93和miR-106b可以增加iPSCs克隆的數目，而抑制這兩種miRNA可以減少克隆的數目。在人成纖維細胞重編程過程中，轉染OSKC的第二天和第七天轉染miR-302b和miR-372可以增加克隆的數目[9]。miR-302b、miR-372和miR-294具有相同的種子序列，能夠阻止在人類永生化表皮細胞中TGF-β誘導上皮-間充質之間的轉化（ETM）。并且，經過改良的具有突變種子序列的miR-294不能抑制TGF-β誘導ETM，這就表明了種子序列在這些miRNAs中的重要性。

miR-21和miR-29a可以干擾iPSC的形成[10]，這兩種miRNA都在小鼠成纖維細胞中大量表達，缺失這兩種miRNA可以通過調節(jié)p53和ERK1/2通路來提高重編程效率。所有的研究都表明，miRNA不僅在維持未分化細胞的狀態(tài)中起作用，也能影響已分化細胞的命運。

3 miRNA對神經系統的作用和重編程誘導作用

3.1 miRNA在神經系統中的表達

miRNA在神經發(fā)育過程中的神經元、神經祖細胞及神經膠質細胞中有特定表達。近年來，miRNA在干細胞及其分化中的作用開始受到關注。研究發(fā)現，某些miRNA，如miR-29和miR-126主要在星形膠質細胞中表達；而miR-138、miR-124主要在中樞神經系統中表達。在中樞神經系統中，部分miRNA的表達具有短暫性和區(qū)域性[11]。部分miRNA的表達模式與其發(fā)育階段存在一定關聯。miR-126可以負調控神經管發(fā)育中血管內皮生長因子A的表達，從而對神經系統血管網絡的形成起間接的調控作用[12]，也有協同調節(jié)神經管發(fā)育過程中類胰島素生長因子、Shh通路和神經營養(yǎng)蛋白通路的作用[13]。

在腦組織中表達最豐富的一類miRNA—miR-124，主要在已分化成熟的神經元中表達。若將miR-124轉染到多種細胞中，可以抑制一系列非神經元轉錄物的表達，并且誘導這些細胞基因組向神經方向轉化[14]。研究發(fā)現[15]，成纖維細胞可以在miR-124的參與下重編程，誘導分化為神經細胞。在功能上，miRNA可以通過引發(fā)靶mRNA的降解和翻譯抑制來介導轉錄后基因的沉默，參與蛋白質表達的調節(jié)，在神經系統分化、發(fā)育及神經系統疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[16]。有研究顯示[17]，miR-124-9-9*不僅能夠使成纖維細胞重編程為神經細胞，而且還可以提高米勒神經膠質細胞編程為視網膜神經元的概率。在已知的miRNA中，大約70%在哺乳動物大腦中有表達。很多miRNA參與了神經系統不同信號轉導通路的基因表達調控且有不同的生理過程，比如神經系統發(fā)生和發(fā)育、神經干細胞的分化、樹突棘形成、神經保護等[16]。有一些miRNA可以參與調節(jié)神經干細胞的分化和命運[18]。miRNA參與了很多神經系統疾病的病理生理過程，如帕金森病、腦腫瘤、精神分裂癥等引起的神經系統損傷[19-20]。

3.2 miRNA參與細胞重編程為神經細胞

3.2.1 miRNA參與重編程為神經前體細胞及神經干細胞2011年3月，Janghwan Kim等[21]把小鼠成纖維細胞重編程為神經前體細胞，他們以病毒為載體將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4個轉錄因子轉入成纖維細胞中，將這些細胞誘導分化為Pax+、Sox1+、Sox17+、T+的神經前體細胞（Neural stem/Progenitor Cells，NPCs）。2011年12月，Ernesto Lujan等[22]將小鼠成纖維細胞誘導分化為NPCs，基因嵌入Sox2-IRES-EGFP的小鼠中原代培養(yǎng)獲得MEF，再將11種轉錄因子轉染成纖維細胞，培養(yǎng)24天后，檢測誘導形成的細胞為NPCs。 2012年2月，Dong Wook Han等[23]通過指定的轉錄因子將成纖維細胞重編程為神經干細胞，實驗中，他們將相結合的轉錄因子誘導小鼠成纖維細胞而獲得iNSCs，此類細胞表現出的細胞形態(tài)、基因表達的表觀遺傳特征、分化電位和自我更新能力與野生型的神經干細胞相似。2012年3月，Marc Their等[24]將成纖維細胞誘導分化穩(wěn)定增殖的神經干細胞，通過組成性誘導Sox2、Klf4、c-Myc，同時在重編程的初始階段嚴格限制Oct4的活性，分化形成了可以傳代＞50代的神經干細胞iNSCs，iNSCs有巢蛋白、Pax6、Olig2的表達，此外，還可以分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。又有研究者用單個轉錄因子Oct4重編程人的血細胞誘導分化為神經祖細胞。在細胞重編程形成神經細胞的過程中，體細胞往往先形成多潛能干細胞再分化為神經細胞，但這一重編程效率很低，并且多數不能傳代生長，還由于缺少再活化的重編程因子，多潛能干細胞往往可能會形成畸胎瘤，用于臨床治療，我們必須考慮形成腫瘤的風險和細胞在體外可自我再生。miRNA在iNSC重編程中的作用可以借鑒對iPSC的研究，有實驗顯示，小鼠和人的iPSC可以通過miRNA的組合和轉錄因子的重編程形成。組合的miRNA和轉錄因子可以使人成纖維細胞完成神經細胞的轉化，并且可以往特定神經細胞類型分化。過表達miR-146可以促進神經干細胞增殖，促進膠質細胞分化。小鼠ESC 特異的 miRNA、miR-291-3p、miR-294、miR-295可以提高Klf4、Oct4、Sox2的誘導多能性，因此，可以篩選和研究NSC特異的miRNA來推動iNSC的形成。

3.2.2 miRNA參與重編程為神經元 2011年 5月，Ulrich Pfisterer等[25]將人成纖維細胞重編程成多巴胺神經元，通過過表達轉錄因子Ascl1、Brn2、Myt1Ⅰ，人成纖維細胞可以高效轉化為功能型神經元。2011年7月，《Cell》上刊登了Esther YSon等[26]的實驗，他們將小鼠和人的成纖維細胞重編程為功能性的運動神經元；同時，也報道了Rajesh Ambasudhan等[27]在一定的條件下，把人成纖維細胞重編程為功能型神經元，miR-124和兩個轉錄因子（MYT1L、BRN2）的組合可以把中胚層人成纖維細胞重編程為外胚層功能型神經元。研究報道[28]，在人成纖維細胞中過表達miR-302/367家族和兩種神經元特異性的miRNA（miR-9/9*、miR-124），可將其重編程為神經元，并且這些細胞可以在裸鼠腦中被觀測到，這推進了細胞重編程的研究，并對神經系統疾病的治療提供了理論支持。

3.2.3 miRNA參與重編程為神經膠質細胞 神經膠質細胞的再生過程中，許多miRNA也參與其中。miR-125b可以調節(jié)少突膠質細胞的增殖和星形膠質細胞的再生。星形膠質細胞在生理和病理的中樞神經系統中起重要作用，它可以參與突觸形成、影響神經遞質吸收等。在大腦發(fā)育過程中，星形膠質細胞中miR-29的表達比在神經元中的表達強烈，并且實驗表明[29]，在細胞培養(yǎng)過程中，miR-29a在星形膠質細胞中表達非常強烈。有研究表明[30]，可以用miR-302/367再加VPA（組蛋白去乙酰基酶抑制劑）重編程人和鼠的星形膠質細胞誘導為神經細胞來治療神經疾病。

4 展望

近年來，細胞替代治療和基因治療為人類征服多種疾病提供了希望。miRNA作為新的研究熱點，在細胞重編程中越來越受到人們的重視。目前已有不少研究證實miRNA在體細胞重編程中起著重要作用，對于miRNA把體細胞重編程為神經細胞的研究也取得了一些進展，但在神經細胞重編程中，miRNA的作用機制仍然需要繼續(xù)深入研究。這些研究必將加速促進體細胞重編程為神經細胞在生物醫(yī)學領域的應用。iNSC細胞的重編程給細胞命運、藥物發(fā)現和細胞移植研究提供了新的方法。隨著研究的深入，iNSC的重編程可以進一步推動重編程的研究及探索。

[1]Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culture by defined factors[J].Cell，2006（4）：663-676.

[2]Woltjen K，Kim SI，Nagy A.The piggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse[J].Methods Mol Biol，2016（1357）：1-22.

[3]RLJudson，JEBabiarz，M Venere，et al.Embryonic stem cell specific micro-RNAs promote induced pluripotency[J].NatBiotechnol，2009（27）：59-61.

[4]FAnokye Danso，CMTrivedi，DJuhr，et al.Highly efficient miRNAmediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency[J].Cell Stem Cell，2011（8）：376-388.

[5]NMiyoshi，H Ishii，H Nagano，et al.Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs[J].Cell Stem Cell，2011（8）：633-638.

[6]BMKim，MCThier，SOh，et al.MicroRNA are indispensable for reprogramming mouse embryonic fibroblasts into induced stem celllike cells[J].PLOS One，2012（7）：39239.

[7]Korpal M，Lee ES，Hu GH，et al.The miR-200 family inhibits epithelial mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of Ecadherin transcripfional repressors ZEB1 and ZEB2[J].J Biol Chem，2008，283（22）：14910-14914.

[8]ZLi，CSYang，KNakashima，et al.Small RNA-mediated regulation of iPS cell generation[J].EMBO J，2011（30）：823-834.

[9]D Subramanyam，S Lamouille，R LJudson，et al.Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].NatBiotechnol，2011（29）：443-448.

[10]CSYang，ZLi，TMRana.MicroRNA modulate iPS cell generation[J].RNA，2011（17）：1451-1460.

[11]Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J].Cell，2007（7）：1401-1414.

[12]James J M，Gewolb C，Bautch VL.Neurovasular development uses VEGF-A signaling to regulate blood vessel ingression into neural tube[J].Develpoment，2009，136（5）：833-841.

[13]Shen W F，Hu Y L，Uttarwar L，et al.MicroRNA-126 regulates HOXA9 by binding to the homeobox[J].Mol Cell Biol，2008，28 （14）：4609-4619.

[14]Cheng L C，Pastrana E，Tavazoie M，et al.miR-124 regulates adult neurogenesis in the subventricular zone stem cell niche[J].Nat Neurosci，2009，12（4）：399-408.

[15]Yoo AS，Sun AX，Li L，et al.MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons[J].Nature，2011，476（7359）：228-231.

[16]Filipowicz W，Bhattacharyya SN，Sonenberg N.Mechanisms of posttranscriptional regulation by microRNAs：are the answers in sight[J].Nat Rev Genet，2008，9（2）：102-114.

[17]Wohl SG，Reh TA.miR-124-9-9*potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia[J].Glia，2016，64（5）：743-762.

[18]Stevavato L，Hicks C，Sinden JD.Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures，Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes[J].Journal of visualized experiments，2015（98）：112-114.

[19]Gao FB.Posttranscriptional control of neuronal development by miceoRNA networks[J].Trends Neurosci，2008，31（1）：20-26.

[20]Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion[J].Stroke，2008，39（3）：959-966.

[21]Janghwan Kim，Jem AEfe，Saiyong Zhu，et al.Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors[J].2011，108（19）：7838-7843.

[22]Ernesto Lujan，Soham Chanda，Henrik Ahlenius，et al.Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing，tripotent neural precursor cells[J].PNAS，2011，109（7）：2527-2532.

[23]Dong Wook Han，Natalia Tapia，Andreas Hermann，et al.Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors[J].Cell，2012（10）：1-8.

[24]Marc Their，Yenal BLakes，Raphaela，et al.Direct Conversion of Fibro blasts into Stably Expandable Neural Stem Cells[J].Cell，2012（10）：473-479.

[25]Ulrich Pfisterer，Agnete Kirkeby，Olof Torper，et al.Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons[J].PNAS，2011，108（25）：10343-10348.

[26]Esther YSon，Justin KIchida，Brian JWainger，et al.Conversion of Mouse and Human Fibroblasts into Functional Spinal Motor Neurons[J].Cell，2011（9）：205-218.

[27]Rajesh Ambasudhan，Maria Talantova，Ronald Coleman，et al.Direct Reprogramming of Adult Human Fibroblasts to Functional Neurons under Defined Conditions[J].Cell，2011（9）：113-118.

[28]Zhou C，Gu H，Fan R，et al.MicroRNA 302/367 Cluster Effectively Facilitates Direct Reprogramming from Human Fibroblasts into Functional Neurons[J].Stem Cells Dev，2015，24（23）：2746-2755.

[29]Ouyang YB，Xu L，Yue S，et al.Neuroprotection by astrocytes in brain ischemia；importance of microRNAs[J].Neuroscience letters，2014（565）：53-58.

[30]Ghasemi-Kasman M，Hajikaram M，Baharvand H，et al.MiroRNA-Mediated In Vitro and In Vivo Direct Conversion of Astrocytes to Astrocytes to Neuroblasts[J].Plos one，2015，10（6）：127.