曹占平 ，宋曉緒 ，范云雙 ，，王尚尚 ，蘇建東 ，劉恩華

（1.天津工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387；2.天津工業(yè)大學(xué) 分離膜與膜過程國家重點實驗室/分離膜科學(xué)與技術(shù)國家級國際合作研究中心，天津 300387；3.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

轉(zhuǎn)移因子（transfer factor，TF）作為一種特定的淋巴細胞因子參與機體的免疫反應(yīng)，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細胞活性、增強機體特異性和非特異性免疫功能等作用.目前，常見的有牛轉(zhuǎn)移因子、豬轉(zhuǎn)移因子、雞轉(zhuǎn)移因子，并且轉(zhuǎn)移因子逐漸應(yīng)用于動物疾病的防治上，如對牛[1]、豬[2]、雞[3]和犬[4]均有明顯的效果；雞轉(zhuǎn)移因子在畜禽病的治療方面也有不少報道[5-7].

目前，制備TF的原料大部分使用豬、雞等動物的脾臟，經(jīng)典的TF生產(chǎn)方法是Laurence法（透析法），此方法操作簡單，但生產(chǎn)周期長，成本高，不適合規(guī)?；a(chǎn)[8-10].文獻[11]報道，兩步 pH調(diào)節(jié)+超濾工藝，適于轉(zhuǎn)移因子的工業(yè)化生產(chǎn).但是脾臟經(jīng)勻漿、凍融后呈稀薄的糊狀，如何去除細胞殘渣是超濾的關(guān)鍵.而管式微濾膜組件的寬流道具有良好的流動狀態(tài)，不易堵塞，膜管可以拆裝和重復(fù)使用，適合脾臟勻漿液生產(chǎn)轉(zhuǎn)移因子的超濾工藝的預(yù)處理[12-14].

本次實驗將新鮮豬脾臟經(jīng)去血、去脂和去筋膜等雜質(zhì)后再進行初絞、精絞、滅活、凍融、離心，取上清液；用管式微濾膜進行過濾，去除上清液中的懸浮物、膠體等較大顆粒的雜質(zhì)，得到澄清透明的料液；然后用截留分子質(zhì)量為6 ku的超濾膜進行進一步純化，去除料液中大分子蛋白等雜質(zhì)，保留小分子的有效成分，即制得畜禽用轉(zhuǎn)移因子半成品，再經(jīng)除菌、檢驗、包裝即得產(chǎn)品.本實驗?zāi)康氖窃谧畲笙薅缺３之a(chǎn)物活性、提高得率，同時適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)需求的基礎(chǔ)上，探索出一條新的生產(chǎn)工藝流程.

1 實驗部分

1.1 實驗材料和設(shè)備

豬脾臟均質(zhì)液：將新鮮豬脾臟經(jīng)去血、去脂和去筋膜等雜質(zhì)后再進行初絞、精絞、滅活、反復(fù)凍融、離心分離取上清液.

管式微濾設(shè)備：由天津海普爾科技股份有限公司提供，管式微濾膜選用孔徑為0.03 μm、外徑為12mm、內(nèi)徑10 mm、長2 m的7根管式微濾膜構(gòu)成的管式膜組件，膜組件過濾面積約0.5 m2.

中空纖維超濾設(shè)備：由天津膜天膜科技股份有限公司提供，超濾膜截留分子質(zhì)量為6 ku，膜組件的過濾面積為2 m2.

其他材料和儀器：分析純氫氧化鈉、潔凈塑料桶（100 L、75 L、25 L、5 L）、量杯（1 000 mL、500 mL、250 mL）、秒表等，均為市售.

1.2 轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)工藝流程

TF分離膜生產(chǎn)工藝流程如圖1所示.

圖1 TF分離膜生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Flow chart of TF production process bymembrane technology

分離膜生產(chǎn)工藝主要處理設(shè)備包括2部分，即管式微濾設(shè)備和中空纖維超濾設(shè)備.管式微濾設(shè)備作用是去除原料物料中的懸浮物、膠體等較大顆粒的雜質(zhì)，得到澄清透明的料液；經(jīng)過管式微濾膜設(shè)備生產(chǎn)的澄清料液再經(jīng)過中空纖維超濾處理純化，去除料液中大分子蛋白等雜質(zhì)，保留6 ku分子質(zhì)量下的小分子物質(zhì)有效成分，即制得半成品.

1.3 實驗方案

1.3.1 管式膜微濾實驗

按實驗要求安裝管式膜組件，純水循環(huán)沖洗3次，測定在0.05 MPa壓力下的純水透水量；用純水將豬脾臟均質(zhì)液稀釋，開泵，選擇低進膜流量和低膜壓力下運行，當均質(zhì)液進入系統(tǒng)循環(huán)，控制操作壓力在0.05 MPa左右，收集微濾透過液，記錄每升透過液的所用時間，每隔15 min記錄脾臟均質(zhì)液和微濾透過液的溫度；透過液收集結(jié)束后，處理脾臟均質(zhì)液的濃縮循環(huán)液；微濾系統(tǒng)進行系統(tǒng)清洗，記錄清洗后的純水透過量.

1.3.2 超濾組件超濾實驗

安裝超濾裝置，純水循環(huán)沖洗3次，測定在0.05 MPa壓力下的純水透水量；將管式微濾設(shè)備收集到的微濾透過液作為超濾系統(tǒng)的待過濾料液，混勻，開泵，在0.05 MPa壓力下收集超濾透過液，記錄收集1 L濾液所需時間.超濾透過液收集結(jié)束后，超濾透過液即作為TF半成品；超濾系統(tǒng)進行系統(tǒng)清洗，記錄清洗后的純水透過量.超濾透過液混勻，留樣測定多肽、核糖含量及TF活性.

1.3.3 膜清洗工藝

管式膜組件和超濾裝置清洗步驟大體相同，視實際情況具體操作.先向微濾原水罐中加入純水，加熱到30～40℃，沖洗管式膜及管路至出水基本無色.排盡裝置中的水，加入氫氧化鈉溶液進行堿洗，系統(tǒng)循環(huán)20～30 min；再次加入純水進行水洗，沖洗到出水口與進水口pH值接近時，繼續(xù)加入純水沖洗，直至濃縮口與進水口pH值接近；膜組件經(jīng)過純化水沖洗完畢后，再注入質(zhì)量分數(shù)為0.5%甲醛溶液，循環(huán)15～30 min，將膜組件用0.5%的甲醛保存起來，再次使用前用純化水洗凈.

膜過濾結(jié)束后，以清洗后純水透過速率為考察指標，比較管式微濾膜和超濾膜的恢復(fù)情況.

1.3.4 多肽及核糖含量測定

采用Lowery（福林酚）法對超濾透過液的多肽含量進行檢測，用二羥基甲苯法測定超濾透過液核糖含量，用E玫瑰花環(huán)法測定超濾透過液活性.

2 結(jié)果與討論

2.1 管式微濾實驗中脾臟均質(zhì)液稀釋方法的確定

管式膜組件的寬流道具有良好的流動狀態(tài)，不易堵塞，膜管可以拆裝和重復(fù)使用，適合具有一定粘度的高固含量的液體物料過濾除雜和提純.本工藝選用管式微濾膜裝置對反復(fù)凍融3次的脾臟均質(zhì)液進行第一次過濾，去除脾臟均質(zhì)液的細胞碎片以及膠體物質(zhì)等，對料液進行澄清；由于均質(zhì)液固含量高、粘稠，不適于管式膜直接過濾，因此需要對均質(zhì)液進行稀釋.

實驗中用純化水稀釋豬脾臟均質(zhì)液有2種稀釋方法.方法①：按照體積比為1∶2的比例用純水直接把25 L均質(zhì)液稀釋至75 L；方法②：按照體積比為1∶1的比例用純水把25 L均質(zhì)液稀釋至50 L，在過濾過程中，隨著微濾透過液被收集10 L后，向均質(zhì)液中不間斷加入純水25 L，加入純水速率與過濾速率基本平衡，直至收集透過液50 L過濾操作結(jié)束.本實驗研究稀釋方法對微濾和超濾的工作效率、微濾操作溫度、微濾和超濾的透過速率的影響以及半成品中多肽、核糖以及活性的影響，從而確定微濾實驗中均質(zhì)液的稀釋方法.

2.1.1 微濾、超濾裝置透過效率

微濾、超濾裝置透過效率結(jié)果如表1和表2所示.

表1 2種稀釋方法的微濾過濾效率Tab.1 MF efficiency of two kinds of dilution methods

表2 2種稀釋方法的超濾過濾效率Tab.2 Ultrafiltration efficiency of two kinds of dilution methods

由表1和表2可見，同樣的待過濾料液體積75 L，透過體積50 L，采用稀釋方法①微濾耗時3.72 h，超濾耗時0.75 h，合計4.47 h.而方法②微濾耗時2.18 h，超濾耗時0.86 h，合計3.04 h；顯然方法②過濾效率更高.因為隨著膜過濾的進行，包含轉(zhuǎn)移因子在內(nèi)的小分子物質(zhì)透過微濾膜被收集，均質(zhì)液原液不斷被濃縮，因此在管式膜待過濾物中不斷補加純化水，可以起到稀釋、沖洗、提高過濾效果的作用.管式膜組件（0.5 m2）每 1 h透過量可達約 20 L，超濾膜組件（2 m2）每1 h透過量可達約50 L以上，過濾效率高、耗時短，可以明顯縮短生產(chǎn)周期，更適合規(guī)模化生產(chǎn).

2.1.2 2種稀釋方法中溶液溫度變化情況

TF是一類具有多種生物學(xué)活性的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，人們普遍認為TF在低溫下維持其生物活性，在高溫下活性會短時間內(nèi)消失[15]，因此為了保證TF的活性，需要控制膜過濾過程中的溫度.如果溫度超過37℃，應(yīng)盡快停止操作，對均質(zhì)液進行降溫處理.微濾設(shè)備由于錯流流速高，液體循環(huán)量大，所以溫度變化比較大，如表3所示.而超濾設(shè)備在運行期間溫度變化較小，基本恒定在13～16℃.

表3 2種稀釋方法的微濾過濾過程中均質(zhì)液溫度變化情況Tab.3 Changes of solution temperaturein tube MF process by two dilution methods

由表3可見，顯示稀釋方法②在整個連續(xù)的過濾過程中，稀釋均質(zhì)液的溫度在18～35.5℃.而稀釋方法①在連續(xù)工作過程中，稀釋液的溫度升高較快，在運行后期達到38℃，為了保證膜在正常溫度下工作，需要對稀釋液進行桶外冰水降溫，以防稀釋液溫度繼續(xù)升高，也保證生產(chǎn)的連續(xù)性.方法①的溫度上升較快與過濾體積有關(guān).由于微濾膜的錯流過濾，料液不斷循環(huán)使料液溫度不斷上升，而①組實驗的料液體積不斷減少，溫度上升速度也較快.而方法②在管式膜待過濾物中不斷補加溫度較低純化水（15℃），可以維持料液溫度處于適宜范圍.

2.1.3 2種稀釋方法對管式微濾液透過速率的影響

以累計收集的透過液體積為橫坐標，每升微濾透過液的透過速率為縱坐標，繪制兩者的關(guān)系如圖2所示.

圖2 2種不同稀釋方法對微濾液透過速率的影響Fig.2 Effects of dilution methods on MF permeate rate

由圖2可見，方法①組在整個過程中膜透過量逐步降低，主要是由于料液濃度及黏度不斷增大，膜表面的形成凝膠層以及膜孔阻塞造成的.而微濾②組在整個過程中膜通量相對穩(wěn)定，剛開始膜通量較低，是由于相對于①組固含量高，在收集10 L透過液后，開始加入純水，透過速率與加純水速度基本恒定，待過濾料液的濃度和溫度相對恒定，因此過濾速率也比較穩(wěn)定.而且由于料液小分子量物質(zhì)被析出，粘度也相對在降低，微濾透過速率在前期甚至略有上升趨勢.在過濾后期，料液固含量增加，膜污染造成透過速率下降.

2.1.4 2種稀釋方法對超濾透過速率的影響

以累計收集的透過液體積為橫坐標，每升超濾透過液的透過速率為縱坐標，繪制兩者的關(guān)系如圖3所示.

圖3 2種不同稀釋方法對超濾液透過速率的影響Fig.3 Effects of dilution methods on UF permeaterate

由圖3可見，微濾透過液采用超濾設(shè)備進行轉(zhuǎn)移因子進一步提純，50 L料液在45 min內(nèi)即可完成，操作溫度穩(wěn)定在13～16℃，超濾透過液可達48 L，回收率達到96%.第1次超濾過程中，透過率下降明顯，而第2次超濾過程中，全程的透過速率變化較小，可能由于按照稀釋方法①收集到的微濾透過液濃度較高造成的，這也與該組生產(chǎn)的TF原液的多肽和核糖含量較高的結(jié)果一致.

2.1.5 2種稀釋方法收集的超濾液活性成分分析

將2種稀釋方法收集的超濾液進行活性成分分析，結(jié)果如表4所示.

表4 均質(zhì)液2種不同稀釋方法的比較Tab.4 Comparison of two dilution methods for homogenate

由表4可知，稀釋方法①的多肽和核糖成分濃度也略高，由于濾過時間較長的原因，而活性略低.在TF半成品中，要求多肽含量每1 mL應(yīng)不小于1.5 mg，核糖含量每1 mL應(yīng)不小于50 μg.因此2種稀釋方法均能達到此標準.

2.2 反復(fù)凍融次數(shù)對管式微濾和超濾透過速率的影響

勻漿液反復(fù)凍融次數(shù)對產(chǎn)品的收率和質(zhì)量有很大的影響.反復(fù)凍融促使細胞完全破碎，使TF充分釋放出來，從而提高產(chǎn)品的收率.勻漿液凍融次數(shù)越多，TF溶液中多肽的濃度就越高.但凍融次數(shù)并非越多越好，凍融次數(shù)越多，核糖降解的越多，其產(chǎn)品中核糖與多肽的比值就越低.另外，勻漿液反復(fù)凍融次數(shù)與管式微濾和超濾的過濾效率也有關(guān).

對勻漿液反復(fù)凍融3次與反復(fù)凍融8次的管式微濾透過速率的變化進行比較，如圖4所示.

圖4 不同凍融次數(shù)對微濾液透過液速率的影響Fig.4 Effect of different freezing and thawing times on microfiltration rate

由圖4可見，勻漿液凍融8次的微濾實驗的透過速率較凍融3次明顯降低.采用同樣的均質(zhì)液稀釋方法②，凍融8次工藝微濾操作需要5.22 h，而凍融3次微濾需要2.18 h.凍融次數(shù)增多，脾細胞破碎率提高，細胞內(nèi)肽類等有效成份溶出率提高，但是細胞殘渣碎片含量也增多，這些細胞殘渣碎片加劇了微濾膜濃差極化的阻力造成透過速率下降.凍融8次的微濾透過液50 L用超濾設(shè)備提純，可回收48 L超濾透過液，而且超濾操作在42 min內(nèi)完成.超濾設(shè)備的過濾速率如圖5所示.

圖5 不同凍融次數(shù)對超濾液透過速率的影響Fig.5 UF permeate rate in different freezing and thawing times for homogenate

由圖5可知，凍融8次的超濾速率比凍融3次的有所提升，這主要是由于本次試驗操作溫度為25℃，而凍融3次的超濾過濾溫度為13～16℃.

不同凍融次數(shù)工藝的比較如表5所示.

從表5可以看出，在規(guī)?；a(chǎn)中凍融次數(shù)要根據(jù)產(chǎn)品活性成分含量和生產(chǎn)效率綜合確定.反復(fù)凍融3次比較合適，既能滿足產(chǎn)品質(zhì)量要求，又能提高生產(chǎn)效率.

表5 不同凍融次數(shù)工藝的比較Tab.5 Comparison of different freeze-thaw times processes

2.3 管式微濾設(shè)備和超濾設(shè)備的清洗恢復(fù)情況

分別以清洗方法和清洗次數(shù)為橫坐標，以純水透過速率為縱坐標，繪制微濾設(shè)備、超濾設(shè)備純水透過速率變化圖如圖6和圖7所示.

圖6 清洗方法對微濾膜純水透過速率的影響Fig.6 Effect of cleaning method on pure water transmission rate of MF

圖7 清洗次數(shù)對膜純水透過速率的影響Fig.7 Effect of cleaning method on membrane pure water transmission rate

由圖6和圖7可知，每一批均質(zhì)液經(jīng)管式微濾膜和超濾設(shè)備過濾結(jié)束后，微濾膜和超濾膜都要盡快進行清洗.微濾膜和超濾膜清洗工藝基本相同.清洗方法為純水沖洗和氫氧化鈉溶液浸泡或低流量循環(huán)清洗.清洗后的純水透過速率作為考察指標比較管式微濾膜和超濾膜的恢復(fù)情況.管式微濾膜在第1次使用后，使用0.1%氫氧化鈉清洗后，膜的純水透過速率分別恢復(fù)到新膜的43.3%；而用1.0%氫氧化鈉清洗后，膜的純水透過速率分別恢復(fù)到新膜的46.3%，純水通量的變化是新膜第1次使用造成的膜的不可逆污染造成的.0.1%和1.0%氫氧化鈉在恢復(fù)膜透過速率的清洗濃度上，差異不明顯，低濃度堿液足以進行膜的清洗.因此，在每次試驗結(jié)束后，微濾和超濾膜都采用純水沖洗和0.1%氫氧化鈉溶液浸泡或低流量循環(huán)的清洗方式.圖7表示經(jīng)過6批次過濾后的微濾膜和超濾膜純水透過速率的恢復(fù)情況.第1次使用后，微濾膜純水透過速率陡降至新膜的43.3%，以后5次使用并清洗后的純水透過速率下降很緩慢，基本都能恢復(fù)到第2次的90%左右.因此，恰當?shù)那逑捶绞交灸鼙ＷC分離膜工藝在TF生產(chǎn)中的連續(xù)性.

2.4 分離膜工藝與傳統(tǒng)工藝比較

采用分離膜工藝運行3批，與傳統(tǒng)工藝對比，測定結(jié)果如表6所示.

表6 分離膜工藝與傳統(tǒng)工藝的比較Tab.6 Membrane technology compared with traditional process

由表6可知，傳統(tǒng)工藝透析法（Laurence法），即直接將離心上清液置于透析袋中，于4℃用等體積的注射用水透析24 h，換注射用水再透析24 h，收集合并透析液.通過對傳統(tǒng)工藝與分離膜工藝對比可發(fā)現(xiàn)采用膜過濾技術(shù)生產(chǎn)TF，縮短了原液生產(chǎn)周期，TF的收率、含量及活性等都有明顯提高，可以作為TF規(guī)?；a(chǎn)的一種方法.

3 結(jié) 論

（1）脾臟均質(zhì)液采用純水1∶1（體積比）稀釋，在過濾過程中不斷添加純水以降低操作溫度、并提高過濾效率.微濾和超濾操作可以在約3 h完成，操作溫度始終低于37℃，更適宜TF的生產(chǎn)，超濾透過液中多肽、核糖的含量也符合半成品的要求.

（2）在大規(guī)模生產(chǎn)中凍融次數(shù)要根據(jù)產(chǎn)品活性成分含量和生產(chǎn)效率綜合確定.反復(fù)凍融3次比較合適，更適宜分離膜工藝操作.

（3）每一批均質(zhì)液經(jīng)管式微濾膜和超濾設(shè)備過濾結(jié)束后，微濾膜和超濾膜都要盡快進行清洗.6批次過濾后的膜通量恢復(fù)情況良好，可用于連續(xù)生產(chǎn).

（4）采用膜過濾技術(shù)生產(chǎn)TF，縮短了原液生產(chǎn)周期，TF的收率、含量及活性等都有明顯提高，可以作為TF規(guī)?；a(chǎn)的一種方式.

[1]KLESIUS P H，F(xiàn)UDENBERG H H.Bovine transfer factor：In vivo，transfer of cell-mediated immunity to cattle with alcohol precipitates[J].Clinical Immunology&Immunopathology，1977，8（2）：238-246.

[2]JAMKAR A V.Immunotherapy of advanced carcinoma maxilla with immunosensitised porcine mesentric lymph node cells with immunospecific xenogenic lymphnode cell transfer factor[J].Indian Journal of Cancer，1980，17（1）：25-30.

[3]KLESIUS P H，GIAMBRONE J J.Adoptive transfer of delayed hypersensitivity and protective immunity to eimeriatenella with chicken-derived transfer factor[J].Poultry Science，1984，63（7）：1333-1337.

[4]SIMON M R，JR S J，F(xiàn)REIER D，et al.Tuberculin-specific transfer factor in dogs[J].Infection&Immunity，1977，18（1）：73-77.

[5]張廣英，徐可利，王玉茂，等.獸用轉(zhuǎn)移因子的應(yīng)用[J].中國畜禽傳染病，1991，60（5）：68-69.ZHANG G Y，XU K L，WANG Y M，et al.The application of the transfer factor in veterinary use[J].Chinese Animal and Poultry Infectious Diseases，1991，60（5）：68-69（in Chinese）.

[6]MADDISON S E，HICKLIN M D，CONWAY B P，et al.Transfer factor：Delayed hypersensitivity to Schistoso mamansoni and tuberculin in Macacamulatta[J].Science，1972，178（4062）：757-759.

[7]MISHRA S S，JAISWAL T N.Transfer of delayed hypersensitivity by dialysable lymphocyte extract from Listeriamonocytogenes sensitized rabbits[J].Indian Vet，1992，69（1）：1-4.

[8]成杰，欒業(yè)俊，仲亞娜，等.轉(zhuǎn)移因子的研究進展 [J].山東畜牧獸醫(yī)，2017，38（8）：55-57.CHENG J，LUAN Y J，ZHONG Y N，et al.Advances in transfer factors[J].Shandong Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2017，38（8）：55-57（in Chinese）.

[9]顧平，陳德有.豬脾轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)工藝的改進[J].中國生化藥物雜志，2001，22（2）：94-95.GU P，CHEN D Y.Improvement of pig spleen transfer factor production process[J].Chinese Journal of BiochemicalMedicine，2001，22（2）：94-95（in Chinese）.

[10]張立武，萬星，孔建平，等.豬脾轉(zhuǎn)移因子的規(guī)?；a(chǎn)工藝研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2011，43（5）：61-63.ZHANG L W，WAN X，KONG J P，et al.Study on large scale production process of pig spleen transfer factor[J].Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2011，43（5）：61-63（in Chinese）.

[11]朱天新，任晚瓊，袁彩君.豬脾轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)方法的比較[J].中國生化藥物雜志，2005，26（1）：44-45.ZHU T X，REN W Q，YUAN C J.Comparison of production methods of pig spleen transfer factor[J].Chinese Journal of BiochemicalPharmaceutics，2005，26（1）：44-45（inChinese）.

[12]劉達玉，鐘世榮.管式膜超濾生黃酒的研究 [J].食品科學(xué)，2004，25（3）：110-112.LIU D Y，ZHONG S R.Study on ultrafiltration of rice film by tubefilm[J].Food Science，2004，25（3）：110-112（inChinese）.

[13]王尚尚，蘇建東，楊燚，等.一種豬脾轉(zhuǎn)移因子純化方法：中國，CN103724419A[P].2014-04-16.WANG S S，SU J D，YANG Y，et al.A method for purification of porcine splenic transfer factor：China，CN103724419A[P].2014-04-16（in Chinese）.

[14]王甜，蘇建東，王尚尚，等.一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法：中國，CN103705539A[P].2014-04-09.WANG T，SU J D，WANG S S，et al.A method for preparing pigspleen and transfer factor：China，CN103705539A[P].2014-04-09（in Chinese）.

[15]王彥宏，冷南，王樹寬，等.不同溫度貯存的轉(zhuǎn)移因子對淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1996，17（3）：240.WANG Y H，LENG N，WANG S K，et al.Effects of different temperature storage transfer factors on lymphocyte proliferation response[J].Journal of the Fourth Military Medical University，1996，17（3）：240（in Chinese）.