李愛欣，李穎異，蔣文燦，胡 欣，李 鑫，曾曉慧，白 瑜

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江611130；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都611130)

鴨瘟(Duck plague，DP)，又稱鴨病毒性腸炎，是由鴨瘟病毒(DPV)引起的鴨、鵝和其它雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性疾病[1]。DPV能夠在鴨或其它水禽體內(nèi)持續(xù)存在，并且定期向體外排毒而在鴨群中廣泛傳播，引起DP的流行，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前國(guó)內(nèi)外沒有確實(shí)有效的治療方式，主要通過肌肉、皮下注射DPV疫苗等方法來(lái)預(yù)防DP的發(fā)生和流行[3]。

黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體整個(gè)免疫系統(tǒng)的重要組成部分。研究表明，使用合適劑量活疫苗經(jīng)黏膜免疫能夠有效預(yù)防雞傳染性支氣管炎、雞新城疫等家禽傳染病[4-5]，且常見活疫苗黏膜接種途徑中，滴鼻免疫綜合效果較好[6-8]。但目前這些方法未見在DP預(yù)防中廣泛應(yīng)用。

IgA、IgM、IgG是機(jī)體抗感染過程中產(chǎn)生的3種主要抗體，其中IgA是黏膜免疫的主要效應(yīng)分子，IgM是抗感染過程中最早出現(xiàn)的抗體，IgG是最主要的抗體[9-10]。綜合檢測(cè)這3種抗體水平可以全面、直觀地評(píng)價(jià)免疫效果。基于此，本研究檢測(cè)了DPV活疫苗滴鼻免疫與肌注免疫鴨的呼吸道、消化道不同組織器官黏膜IgA、IgG、IgM的含量，并結(jié)合攻毒試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)不同免疫方式誘導(dǎo)的黏膜免疫效果，為臨床DP選擇滴鼻免疫在鴨病防治上的實(shí)際應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 鴨必應(yīng)-鴨瘟活疫苗，500羽份/瓶，購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；DPV Chv強(qiáng)毒株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心分離鑒定；鴨IgA ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20161206)、鴨IgG ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20161206)、鴨IgM ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20161206)，均購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司。1日齡奧白星肉鴨，購(gòu)自成都克里莫育種有限公司。

1.2 雛鴨免疫試驗(yàn)84羽1日齡雛鴨，正常飼養(yǎng)至21日齡，隨機(jī)分組后進(jìn)行下述免疫試驗(yàn)(表1)。

表1 雛鴨免疫的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design for antibody detection experiment

1.3 免疫鴨的抗體檢測(cè) 于首免后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d分別隨機(jī)選取對(duì)照組、一免滴鼻組、一免肌注組各3羽，采集其鼻腔拭子、氣管、腺胃、十二指腸、直腸各2塊組織樣品。將組織樣品分別放入裝有1 mL PBS的EP管中剪碎，4℃放置24 h后1 000 r/min離心10 min、8 000 r/min離心6 min后取上清液，按ELISA試劑盒說明操作，檢測(cè)鴨鼻腔及各組織器官中特異性抗體含量。二免滴鼻組、二免肌注組分別于首免后第14 d、21 d、28 d、35 d、42 d各隨機(jī)選取3羽采樣，采樣及抗體檢測(cè)方法同一免組。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行初步處理及整理，建立試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD450nm值的方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2為0.9678～0.983)，將測(cè)得的OD450nm值換算為抗體滴度，并使用GraphPad Prism 7.0軟件統(tǒng)計(jì)繪制各組鴨消化道、呼吸道各組織器官IgA、IgG、IgM抗體滴度隨時(shí)間變化的直方圖。

1.4 攻毒試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將30羽1日齡雛鴨按如下分組：一免滴鼻組、肌注組，各6羽，于21日齡時(shí)滴鼻/肌注接種1羽份鴨瘟活疫苗；二免滴鼻組、肌注組，各6羽，于21日齡、28日齡各滴鼻或肌注接種1羽份鴨瘟活疫苗；對(duì)照組6羽，不接種疫苗。56日齡(即免疫后35 d)時(shí)所有鴨均肌注100 LD50鴨瘟Chv株強(qiáng)毒液，觀察18 d，每天記錄鴨發(fā)病死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 各組鴨抗體檢測(cè)結(jié)果 將84羽21日齡雛鴨隨機(jī)分5組，分別為一免滴鼻組(NAⅠ)與一免肌注組(IMⅠ)(僅免疫一次鴨瘟活疫苗)、二免滴鼻組(NAⅡ)與二免肌注組(NAⅡ)(首免后7 d加強(qiáng)免疫一次鴨瘟活疫苗)、對(duì)照組。首免后，每隔7 d隨機(jī)選取各組各3羽鴨，采用ELISA法檢測(cè)其呼吸道與消化道各組織器官黏膜中DPV特異性IgA抗體水平。結(jié)果顯示，除對(duì)照組外，各組雛鴨免疫后7 d均可檢出IgA，免疫后42 d該抗體水平仍顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)。除十二指腸外，滴鼻組鴨該抗體均于免疫后21 d達(dá)到最高水平，較肌注組早7 d達(dá)到峰值。滴鼻組鴨鼻、氣管、十二指腸中該抗體峰值均略高于肌注組(p＞0.05)，二免滴鼻組鴨胃、直腸中該抗體峰值均高于肌注組(p＜0.05)(圖1)。表明，滴鼻接種能夠較早誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫，并且達(dá)到相對(duì)高的IgA抗體水平。

圖1 各組鴨不同組織器官特異性Ig A抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The dynamics of DPV specific IgA titers in the ducklings from different groups

除對(duì)照組外，各組鴨各組織器官于免疫后7 d即可檢出IgG，且于免疫后14 d達(dá)到峰值，免疫后42 d仍能檢出該抗體。滴鼻組氣管、胃、十二指腸3個(gè)器官均較肌注組IgG抗體水平高(p＜0.05)。二免肌注組鴨鼻、胃、直腸中該抗體峰值高于滴鼻組(p＜0.05)，其余2個(gè)組織器官(十二指腸、氣管)該抗體水平兩組基本持平(p＞0.05)。結(jié)果表明滴鼻與肌注刺激黏膜產(chǎn)生的IgG抗體水平相差不大，這與IgG為血源性抗體，在黏膜中含量不高有關(guān)。

各組鴨各組織器官于免疫后7 d即可檢出IgM抗體且達(dá)到峰值，隨后迅速降低。除十二指腸一免后兩組該抗體水平持平外(p＞0.05)，其它組織器官該抗體水平滴鼻組均顯著低于肌注組(p＜0.01)。二免滴鼻組鴨的胃、直腸該抗體峰值顯著高于肌注組(p＜0.01)，僅氣管該抗體水平顯著低于肌注組(p＜0.01)。表明一免后滴鼻和肌注對(duì)IgM抗體水平影響不大，但二免滴鼻組粘膜免疫效果略優(yōu)于肌注組。

綜合圖1、2、3，滴鼻組與肌注組經(jīng)活疫苗免疫后鴨黏膜中各種DPV特異性抗體水平較對(duì)照組均有明顯升高(p＜0.01)。這3種抗體在機(jī)體相同器官的產(chǎn)生發(fā)展規(guī)律與齊雪峰的研究結(jié)果基本一致[11]：兩種免疫途徑免疫鴨各器官黏膜抗體水平中IgM峰值出現(xiàn)時(shí)間最早，且滴度下降較快；IgA抗體水平于各器官黏膜中最高，且存留時(shí)間較長(zhǎng)，免疫后42 d仍然能檢測(cè)到高滴度IgA；通過對(duì)兩種途徑免疫鴨黏膜中各抗體滴度的比較顯示：滴鼻免疫DPV活疫苗鴨黏膜中的IgA抗體滴度高于肌注免疫，但兩種免疫方式對(duì)IgG和IgM抗體水平影響不顯著。

圖2 各組鴨不同組織器官特異性IgG抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The dynamics of DPV specific IgG titers in the ducklings from different groups

圖3 各組鴨不同組織器官特異性IgM抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The dynamics of DPV specific IgM titers in the ducklings from different groups

表2 免疫鴨的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Protection of immunized ducklings against DPV challenging

2.2 免疫鴨的攻毒試驗(yàn)結(jié)果 采用相同的方式免疫鴨后以100倍LD50劑量的鴨瘟Chv株強(qiáng)毒攻擊。結(jié)果顯示，經(jīng)過一次加強(qiáng)免疫后，滴鼻組鴨的攻毒保護(hù)率從83.33 %上升至100 %；肌注組保護(hù)率均為100 %。這表明低免疫劑量滴鼻有一定的免疫不確實(shí)的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)中肌注組達(dá)到100 %保護(hù)率，但也不能忽略實(shí)際生產(chǎn)中肌注應(yīng)激性較大的缺點(diǎn)。

3 討論

臨床證實(shí)，使用DPV活疫苗預(yù)防鴨瘟能起到較好的效果，但以往對(duì)免疫效果的評(píng)價(jià)常局限于血清中特異性IgG這一個(gè)指標(biāo)。95 %以上病原體的入侵發(fā)生在人或動(dòng)物的黏膜組織，黏膜組織中的黏膜免疫系統(tǒng)(Mucosal immune system，MIS)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體抗感染的第一道免疫屏障，對(duì)預(yù)防通過黏膜入侵機(jī)體的病原體引起的疾病具有重要意義，黏膜中特異性IgA水平是反映黏膜免疫效果的重要指標(biāo)[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鴨消化道及呼吸道黏膜中抗DPV特異性IgA、IgM、IgG的產(chǎn)生和變化規(guī)律各有其特點(diǎn)，并且與其在血清中產(chǎn)生的規(guī)律有一定的相似之處[15]，免疫后Ig M檢出時(shí)間最早下降最快且含量最少，IgA、IgG含量較高且能維持一定時(shí)間。IgM在緊急預(yù)防和早期免疫中發(fā)揮重要作用，在采樣的各器官均最先產(chǎn)生，為IgA和IgG進(jìn)一步中和病原奠定基礎(chǔ)[5,11]。而IgA于免疫兩周后達(dá)到峰值且能維持較長(zhǎng)時(shí)間，該類抗體作為黏膜免疫的主要效應(yīng)分子，是黏膜中檢出滴度最高的一類抗體，在血清中含量不高，符合其主要由黏膜淋巴細(xì)胞分泌的特性[14]。IgG與IgA相反，IgG為血源性抗體，在血清中含量更高，在黏膜中的含量要低一些，且有研究顯示動(dòng)物機(jī)體消化道黏膜固有層中可分泌IgG的B細(xì)胞數(shù)量較少，黏膜分泌液中的IgG主要來(lái)源于血清[5,11]。3種特異性抗體的產(chǎn)生與消失均遵循一個(gè)較為固定的規(guī)律，不易受免疫方式的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DPV活疫苗經(jīng)滴鼻和肌注兩種不同途徑免疫鴨，均可以誘導(dǎo)鴨呼吸道和消化道局部黏膜產(chǎn)生DPV特異性抗體，具有一定的保護(hù)力。肌注雖然不能像滴鼻那樣直接激活黏膜免疫，但DPV活疫苗肌注免疫鴨糞便中的病毒進(jìn)入環(huán)境，可以重新進(jìn)入雛鴨體內(nèi)，接觸黏膜誘導(dǎo)免疫[16]。而通過滴鼻接種DPV活疫苗，可以使DPV弱毒同時(shí)接觸鴨鼻、喉等呼吸道器官及其咽、食道等消化道，且在呼吸道黏膜致敏的淋巴細(xì)胞也可以傳播到消化道等其它器官的黏膜組織，使消化道黏膜也能檢測(cè)出較高滴度的IgA[17]。綜合各項(xiàng)數(shù)據(jù)可知，使用DPV活疫苗通過滴鼻免疫可以激發(fā)較好的免疫效力，但也有其缺點(diǎn)。

由于目前尚無(wú)市售DPV專用滴鼻疫苗，本實(shí)驗(yàn)采用了市售常用的商品疫苗，這對(duì)滴鼻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生一定影響。一次免疫時(shí)滴鼻組鴨IgM抗體在各器官的峰值均普遍低于肌注組鴨，表明低劑量的該DPV商品疫苗滴鼻誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM的速度較肌注慢、水平低，早期保護(hù)力較弱，二次免疫后可以加強(qiáng)早期保護(hù)力，誘導(dǎo)較高且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的抗體水平。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示滴鼻組的DPV特異性IgA抗體水平較肌注組提早7 d達(dá)到峰值，二次免疫后的5個(gè)采樣器官中，有4個(gè)器官(鼻、氣管、腺胃、直腸)抗體峰值均超過肌注組，僅1個(gè)器官該抗體峰值與肌注組持平。這表明滴鼻使DPV弱毒直接接觸黏膜，相較肌注更快、更多地誘導(dǎo)了黏膜免疫的主要效應(yīng)分子IgA的產(chǎn)生。滴鼻的優(yōu)點(diǎn)在于激發(fā)免疫應(yīng)答快，提高免疫劑量后產(chǎn)生的免疫效果較肌注更好[18]，且較肌注產(chǎn)生的應(yīng)激性小，能夠避免肌注所致防衛(wèi)機(jī)能減弱、易引發(fā)感染引發(fā)疾病等情況發(fā)生[19]。在臨床中進(jìn)行滴鼻免疫時(shí)，會(huì)出現(xiàn)液體滑脫現(xiàn)象，參考雞用滴鼻瓶進(jìn)一步改進(jìn)盛裝疫苗液的容器，可能會(huì)彌補(bǔ)這一不足[18]，或者摸索合適的免疫劑量，進(jìn)行二次免疫，均能夠優(yōu)化滴鼻免疫效果。

本研究結(jié)果表明，DPV活疫苗滴鼻免疫可以誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生與肌注接近同等的保護(hù)力，并且其應(yīng)激性相對(duì)較小，使用專用容器或二次免疫均能夠優(yōu)化滴鼻免疫的效果。為滴鼻免疫在鴨病防治上的實(shí)際應(yīng)用提供參考和依據(jù)。