劉虹秀，程玉笛，黨光輝，李田田，李 鶴，崔子寅，宋寧寧，陳利蘋，劉思國

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱150069)

副結(jié)核病(Paratuberculosis)又稱為副結(jié)核性腸炎，是由副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP)引起的反芻動物的慢性消化道疾病，該病以頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺襞為特征。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須通報(bào)的動物疫病，我國將其列為B類疫病。根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性及致病力將MAP分為牛型、羊型和生物中間型3個(gè)亞型[1]。副結(jié)核病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，近年來我國發(fā)病率也呈上升趨勢[2]，給乳制品和牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此受到各國的高度重視，并投入大量人力、財(cái)力研究其防治措施[3]。

MAP的分離鑒定對了解我國奶牛副結(jié)核病的流行特點(diǎn)及病原學(xué)研究均具有重要意義，本研究采集新疆某奶牛場產(chǎn)奶量下降、腹瀉消瘦疑似副結(jié)核病患牛的直腸刮取物，對其進(jìn)行分枝桿菌的分離培養(yǎng)及抗酸染色，應(yīng)用分枝桿菌種及型特異性PCR方法和序列分析，對分離株進(jìn)行種和亞型的鑒定，確定了3株分離菌為牛型副結(jié)核分枝桿菌，為進(jìn)一步研究副結(jié)核病的流行病學(xué)和病原學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料MAP k10標(biāo)準(zhǔn)株由本實(shí)驗(yàn)室保存；鳥分枝桿菌CVCC277購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；新疆某牛場疑似副結(jié)核病牛的直腸刮取物樣品37份；氯代十六烷基吡啶(HPC)、萘啶酮酸鈉鹽(naladixic acid)、萬古霉素、兩性霉素B購自美國Sigma公司；腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、7H9液體培養(yǎng)基購自美國BD公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Premix ExTaqDNA Polymerase購自TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 多重PCR引物(IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA gene)[4]、MAP分型鑒定引物(DMC529、DMC531、DMC533)[5]，均由哈爾濱博仕生物技術(shù)公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 直腸刮取物樣品處理 采用改良的NADC[6]法，稱取直腸刮取物樣品1 g～2 g加入35 mL滅菌雙蒸水中震蕩，室溫靜置30 min后吸取全部上清經(jīng)1 700 r/min離心20 min后棄掉上清，沉淀用含0.95%氯代十六烷基吡啶(HPC)的BHI培養(yǎng)基，即HPC-BHI溶液30 mL重懸，37℃孵育過夜。1 700 r/min離心20 min后棄上清，沉淀用1 mL混合抗生素液(100μg/mL naladixic acid；100μg/mL萬 古 霉素；50μg/mL兩性霉素B)重懸，37℃放置過夜，取0.2 mL懸液接種卵黃瓊脂培養(yǎng)管(含50μg/mL naladixic acid；50μg/mL萬古霉素)。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及與抗酸染色鏡檢 培養(yǎng)時(shí)先將接種后的卵黃瓊脂培養(yǎng)基傾斜放置于37℃溫箱培養(yǎng)1～2周，然后將培養(yǎng)基豎直放置，繼續(xù)培養(yǎng)，每周查看培養(yǎng)基生長情況和污染狀況，直至第12周。觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行抗酸染色并在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5 3株分離菌的多重PCR鑒定 挑取單菌落接種于7H9液體培養(yǎng)基中，37℃搖床100 r/min培養(yǎng)8周，之后采用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。以IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA gene 5對引物對分離菌進(jìn)行多重PCR鑒定，反應(yīng)程序：95℃8 min；95℃60 s、60℃40 s、72℃35 s，29個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。多重PCR的5個(gè)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上很容易區(qū)分，其中16S rRNA基因?qū)λ蟹种U菌具有特異性，可以擴(kuò)增出484 bp的產(chǎn)物，MAP的IS900基因具有特異性，PCR可擴(kuò)增出398 bp的產(chǎn)物，IS901是鳥分枝桿菌特異性基因，可擴(kuò)增出753 bp的產(chǎn)物，296 bp的產(chǎn)物來自鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的特異性基因DT1，所有鳥分枝桿菌亞種均可擴(kuò)增出IS1311基因的608 bp的產(chǎn)物。

1.6 MAP亞 型 鑒 定 以DMC529、DMC531、DMC533為引物進(jìn)行MAP亞型鑒定，反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測定并對PCR結(jié)果比對分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與抗酸染色鏡檢 經(jīng)處理的37份直腸刮取物樣品經(jīng)過5～14周培養(yǎng)后，其中7份樣品在含分枝桿菌素的卵黃瓊脂培養(yǎng)基上長出菌落，初始菌落很小(直徑1 mm)，無色半透明半球狀，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，菌落變大(4 mm～5 mm)不透明，菌落的形態(tài)從光滑變粗糙，從半球狀變?yōu)槿轭^狀。挑取單菌落進(jìn)行抗酸染色，在顯微鏡下可觀察到紅色略彎曲的細(xì)長桿菌，呈單個(gè)或分支狀排列，符合分枝桿菌的形態(tài)學(xué)特征及抗酸染色特性(圖1)，表明所分離培養(yǎng)的7株分離菌均為抗酸染色陽性菌。

圖1 副結(jié)核分枝桿菌分離株抗酸染色結(jié)果Fig.1 Acid-fast staining of the M.paratuberculosis isolates

2.2 分枝桿菌種的多重PCR鑒定 提取7株分離菌的基因組為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，利用多重PCR方法鑒定的7株分枝桿菌中有3株分離菌擴(kuò)增得到約400 bp、500 bp、600 bp 3條特異性條帶，分別對應(yīng)IS900、16S rRNA、IS1311 3個(gè)基因，與MAP陽性對照k10標(biāo)準(zhǔn)株一致，表明該3株分離株為MAP(圖2)，分別命名為MAP-XJB01、MAP-XJB13、MAP-XJB37。

圖2 副結(jié)核分枝桿菌分離株多重PCR檢測結(jié)果Fig.2 Detection of the M.paratuberculosis isolates by multiplex PCR

2.3 MAP的亞型鑒定 用亞型特異性DMC529、DMC531、DMC533引物對已鑒定為MAP的3株分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增分型。結(jié)果顯示，3株MAP的DNA均擴(kuò)增得到約300 bp的預(yù)期產(chǎn)物(圖3)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，參照Collins[5]發(fā)表的鑒定MAP牛型和羊型的方法，通過Blast進(jìn)行序列比對，測序所得的序列與報(bào)道的牛型MAP的序列同源性為100 %，確定本研究分離培養(yǎng)的3株MAPXJB01、MAP-XJB13、MAP-XJB37均為牛副結(jié)核分枝桿菌。MAP的不同亞型在流行上存在差異，已經(jīng)在牛和其它物種中發(fā)現(xiàn)牛型流行株，而目前羊型流行株僅在綿羊中有報(bào)道[7]。造成這種結(jié)果可能是由于不同亞型MAP具有一定程度的宿主特異性、偏好性或適應(yīng)性，在不同條件下有不同的感染方式或環(huán)境存活能力，這些條件傾向于感染一種或其它寄主物種。在實(shí)際生產(chǎn)中可以通過加強(qiáng)管理減少不同物種在易感時(shí)間內(nèi)的接觸來降低MAP不同亞型在不同物種之間感染傳播的機(jī)會。

MAP屬于胞內(nèi)寄生菌，具有較強(qiáng)的環(huán)境和宿主適應(yīng)性。對于病原學(xué)檢測，由于對樣品處理要求高、分離方法復(fù)雜、培養(yǎng)周期長，MAP的分離培養(yǎng)一直是個(gè)難題，本研究從患牛直腸刮取物中分離到MAP，證明本研究所用的分離培養(yǎng)方法可行，可以為MAP的分離培養(yǎng)提供參考。雖然目前檢測副結(jié)核病有糞便培養(yǎng)、抗酸染色、抗體ELISA檢測等多種方法，但由于缺乏準(zhǔn)確的檢測及檢測標(biāo)準(zhǔn)，造成很多國家的動物副結(jié)核病患病率較難估計(jì)。本研究選用的多重PCR檢測方法可以對分枝桿菌進(jìn)行快速、特異、靈敏的檢測和鑒定，為進(jìn)一步開展MAP病原學(xué)和流行病學(xué)研究提供了必要的研究資料。

圖3 副結(jié)核分枝桿菌分離株亞型鑒定結(jié)果Fig.3 Subtype identification of the M.paratuberculosis isolates