李 霆，李 茜，王 娜，崔貝貝，仇松寅，張永寧，吳曉東，吳紹強(qiáng)，韓雪清，林祥梅*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100176；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島266032)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報告?zhèn)魅静。筛别げ《究坡檎畈《緦俚男》雌c獸疫病毒(PPRV)感染小反芻動物引起的一種以突然發(fā)熱、眼鼻排出分泌物、口腔潰瘍、肺炎和腹瀉等為特征的傳染病，山羊高度易感[1]。該病于1942年首次在非洲發(fā)生，隨后在非洲大陸廣泛傳播，現(xiàn)已波及中東、西亞、南亞等地區(qū)[2-3]。該病于2007年傳入我國西藏地區(qū)[4]，2013年又在新疆暴發(fā)，由于山羊和綿羊的大范圍流動，該病已在我國境內(nèi)迅速傳播，截止2014年9月，全國共有22個省或自治區(qū)的256個縣暴發(fā)疫情[5]，嚴(yán)重威脅了我國的畜牧業(yè)生產(chǎn)。

PPRV為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大小為15948個核苷酸，基因組3'末端為前導(dǎo)序列，5'末端為尾隨序列，6個編碼框基因排列順序為3'-N-P-M-F-H-L-5'，依次編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)。另外，P基因還編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白C和V[6-7]。P基因總長度為1 655個核苷酸，開放閱讀框長度為1530個核苷酸，編碼509個氨基酸，P蛋白理論分子質(zhì)量約為54.8 ku，但由于P蛋白表達(dá)后大量的磷酸化修飾，聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示實際分子量為75 ku[8]。P蛋白是一種多功能蛋白，已有研究表明P蛋白可以在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮作用：P蛋白能與不同形式的N蛋白結(jié)合或單獨(dú)與N蛋白-RNA模板復(fù)合物結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄；P蛋白與L蛋白相結(jié)合形成依賴于RNA的RNA聚合酶，然后與N蛋白-RNA模板結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體，進(jìn)行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[9-10]。此外，對麻疹病毒研究顯示P蛋白能夠阻斷JANUS激酶1(Janus kinase 1，JAK1)對信號的傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)的磷酸化而阻斷干擾素反應(yīng)[11-14]，這提示PPRV P蛋白可能具有相似的拮抗干擾素活性。為研究PPRV P蛋白的生化功能，本研究利用Tet on系統(tǒng)建立了可誘導(dǎo)表達(dá)PRRV P蛋白的細(xì)胞系，為PPRV的致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑 含flag標(biāo)簽的pcDNA4/TO由本實驗室改造并保存，T-REx293細(xì)胞由本實驗室保存；KOD plus酶購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購自NEB公司；病毒RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒和核酸凝膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)公司；強(qiáng)力霉素、稻瘟菌素、flag單克隆抗體(MAb)、β-actin MAb、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(IgG-HRP)購自Sigma公司；磷酸化p-STAT1 MAb和STAT1 MAb均購自CST公司；AlexaFluor 594標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗、博來霉素、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自Thermo公司；轉(zhuǎn)染試劑jet-PRME購自Polyplus公司；ECL發(fā)光液購自GE公司；聚肌胞苷酸(Polvriboinsine-polyribocyaidylic acid，polyI:C)購自Invivogen公司；PPRV購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司；PPRV山羊陽性血清由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心吳曉東研究員惠贈。

1.2 pcDNA4/TO-PPRVP重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的PPRV Nigeria75/1株(X74443.2)的P基因序列設(shè)計引物PRR-P-F：5'-GATCGGCCGGCCG ATGGCAGAAGAACAAGCATAC-3'/PRR-P-R：5'-GA TCGGCGCGCCTTACGGCTGCTTGGCA-3'。根 據(jù) 病毒RNA提取試劑盒說明書，提取PPRV總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得PPRV全長p基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)FseⅠ/AscⅠ雙酶切后克隆至pcDNA4/TO載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4/TO-PPRVP，并經(jīng)過酶切和測序鑒定。

1.3 可誘導(dǎo)表達(dá)P蛋白細(xì)胞系的篩選及建立 參照jetPRME轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pcDNA4/TO-PPRVP轉(zhuǎn)染至已穩(wěn)定轉(zhuǎn)入pcDNA6/TR質(zhì)粒的T-REx293細(xì)胞。按照有限稀釋法將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2 d～3 d后用300μg/mL的博來霉素和10μg/mL的稻瘟菌素加壓篩選，待細(xì)胞長滿后依次擴(kuò)增至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。傳代并分出部分細(xì)胞至新6孔板內(nèi)，添加或者不添加1μg/mL強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)P蛋白表達(dá)，24 h后收集細(xì)胞，以鼠抗flag MAb(1∶5 000)為一抗，以山羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，采用western blot檢測誘導(dǎo)后P蛋白的表達(dá)。將western blot篩選獲得的強(qiáng)陽性克隆，經(jīng)間接免疫熒光(IFA)進(jìn)一步驗證誘導(dǎo)P蛋白的表達(dá)情況，即以鼠抗flag MAb(1∶500)為一抗，以羊抗鼠IgG-AlexFlur594(1∶500)為二抗，在蔡司LSM880激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光染色結(jié)果。擴(kuò)增和保存表達(dá)量高的細(xì)胞株，命名為T-REx293-PPRV-P。

1.4 T-REx293-PPRV-P細(xì)胞系表達(dá)穩(wěn)定性的檢測 將T-REx293-PPRVP在博來霉素篩選壓力下常規(guī)傳代，將第二代細(xì)胞系添加1μg/mL強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)24 h、48 h和72 h后，通過western blot檢測誘導(dǎo)不同時間后P蛋白的表達(dá)穩(wěn)定性；為了檢測不同代次細(xì)胞系的P蛋白表達(dá)穩(wěn)定性，在傳至第2代、第8代、第16代時分別添加1μg/mL的強(qiáng)力霉素，誘導(dǎo)表達(dá)24 h后進(jìn)行western blot檢測重組P蛋白的表達(dá)。

1.5 重組P蛋白的活性檢測 在鋪滿T-REx293-PPRV-P細(xì)胞系6孔細(xì)胞板內(nèi)分別添加1μg/mL強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)P蛋白表達(dá)，24 h后裂解細(xì)胞總蛋白并定量，用山羊抗PPRV陽性血清為一抗，以兔抗山羊IgG-HRP(1∶2 000)為二抗，western blot檢測P蛋白的反應(yīng)原性。在鋪有T-REx293-PPRV-P細(xì)胞系的6孔細(xì)胞板內(nèi)分別添加或者不添加1μg/mL強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)P蛋白24 h后，再轉(zhuǎn)染polyI∶C誘導(dǎo)STAT1磷酸化，轉(zhuǎn)染12 h后經(jīng)western blot檢測P蛋白的表達(dá)以及P蛋白的表達(dá)對STAT1磷酸化修飾水平的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tet on細(xì)胞系的篩選和鑒定 以PPRV cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出長度約1.5 kb片段(圖1A)，雙酶切后克隆至pcDNA4/TO載體中。重組質(zhì)粒經(jīng)FseⅠ/AscⅠ雙酶切鑒定后顯示插入片段約1.5 kb，與預(yù)期相符合(圖1A)。測序表明插入片段基因序列正確，片段大小為1 530 bp，表明重組質(zhì)粒pcDNA4/TO-PPRVP構(gòu)建正確。將此pcDNA4/TO-PPRVP轉(zhuǎn)染至T-REx293細(xì)胞中，經(jīng)博來霉素和稻瘟菌素加壓培養(yǎng)，挑選單細(xì)胞克隆株，并對挑選的約20個單細(xì)胞克隆株通過western blot檢測重組P蛋白的flag標(biāo)簽，結(jié)果有多株細(xì)胞克隆在誘導(dǎo)之后表達(dá)了分子量約75 ku的特異蛋白，而未誘導(dǎo)細(xì)胞則未表達(dá)此蛋白(圖1B)。挑取其中表達(dá)量最高的細(xì)胞克隆經(jīng)IFA檢測，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞株均呈現(xiàn)出均勻的紅色熒光，且P蛋白主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)，而未誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)則無熒光(圖1C)。上述western blot和IFA結(jié)果表明經(jīng)篩選獲得了可誘導(dǎo)表達(dá)PPRVP蛋白細(xì)胞系，命名為T-REx293-PPRV-P。

圖1 表達(dá)PPRV P蛋白細(xì)胞系的篩選和鑒定Fig.1 Screening and identification of T-REx293-PPRV-phosphoprotein cell line

2.2 T-REx293-PPRV-P細(xì)胞系表達(dá)P蛋白的穩(wěn)定性檢測 將第二代細(xì)胞系添加1μg/mL強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后不同時間經(jīng)western blot檢測結(jié)果顯示P蛋白在誘導(dǎo)24 h、48 h和72 h持續(xù)表達(dá)，且表達(dá)量隨時間延長而遞增(圖2A)。表明該細(xì)胞系表達(dá)的P蛋白在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后72 h以內(nèi)均能夠穩(wěn)定表達(dá)，且未出現(xiàn)明顯降解。對不同代次細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明第2代、第8代、第16代細(xì)胞系均能夠經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生目的條帶(圖2B)。表明，建立的細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)PPRV P蛋白。

2.3 重組P蛋白的活性檢測 將強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的細(xì)胞系裂解物進(jìn)行western blot檢測。結(jié)果顯示，強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解產(chǎn)物均能夠與PPRV陽性血清反應(yīng)，產(chǎn)生75 ku的目的條帶，與flag標(biāo)簽抗體鑒定結(jié)果相同，而與陰性血清不發(fā)生反應(yīng)(圖3A)。表明重組P蛋白具有較好的反應(yīng)原性。細(xì)胞系經(jīng)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)P蛋白表達(dá)，然后采用干擾素誘導(dǎo)劑polyI:C誘導(dǎo)細(xì)胞STAT1磷酸化，通過western blot檢測P蛋白對STAT1的磷酸化的影響。結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)的P蛋白可以有效抑制poly-I:C誘導(dǎo)的STAT1的磷酸化(圖3B)。表明，重組P蛋白具有拮抗干擾素產(chǎn)生的活性。

綜上所述，本研究建立了可誘導(dǎo)表達(dá)PPRV P蛋白的T-REx293-PPRV-P細(xì)胞系，該Tet on細(xì)胞系表達(dá)的重組P蛋白不僅具有與天然PPRV P蛋白類似的活性，還可以應(yīng)用于PPRV P蛋白對干擾素等免疫信號通路的調(diào)控分析，進(jìn)而為PPRV P蛋白后續(xù)的功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。

圖2 T-REx293-PPRV-P細(xì)胞系表達(dá)P蛋白的穩(wěn)定性檢測Fig.2 Stability detection of P protein expressed in T-REx293-PPRV-P cell line

圖3 重組P蛋白的活性檢測Fig.3 Identification of the activity of recombinant P protein