楊彥超，王 靜，李 凱，祁小樂，崔紅玉，高玉龍，劉長軍，高宏雷，王笑梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150069)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由RE病毒(REV)引起的雞、火雞、鴨、鵝、日本鵪鶉、孔雀等禽類的一群病理綜合征[1]，主要特征為急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤和淋巴組織慢性腫瘤的形成及矮小綜合征等[2-3]。該病是繼馬立克氏病(Marek's disease，MD)和禽白血病(Avian leukemia，AL)之后的第三種禽類病毒性腫瘤病，同時也是一種重要的免疫抑制性疾病，能夠引起禽的胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮[4]，免疫力下降甚至喪失，導(dǎo)致免疫抑制，使患病禽類繼發(fā)感染其它病原，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

REV根據(jù)基因組不同分為兩種類型，即完全復(fù)制型(REV-A)和不完全復(fù)制型(REV-T)。REV-A基因組長約9.0 kb，而REV-T基因組長約5.7 kb，這是因為后者基因組中g(shù)ag-pol區(qū)和env區(qū)存在基因缺失[5]。REV的基因組包括兩個開放閱讀框，編碼結(jié)構(gòu)核心蛋白(gag)、酶蛋白(pol)和囊膜蛋白(env)，其中env蛋白能夠被裂解為gp20和gp90[6]，而gp90是REV的主要免疫原性蛋白，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[7-8]。本研究通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了REV的env全長蛋白，純化后免疫SPF雞，結(jié)果表明env蛋白具有良好的免疫原性，為REV亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料pMD18T-env(HLJR0901)重組質(zhì)粒由本實驗室保存[9]；SPF雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物實驗中心；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、TOP10F'感受態(tài)細(xì)胞均由本實驗室保存；畢赤酵母表達(dá)載體pAO815、畢赤酵母菌株SMD1168和GS115均購自Invitrogen公司；Mut ExpressTMII Fast Mutagenesis Kit購自Vazyme公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；Prime STAR DNA HS聚合酶、限制性內(nèi)切酶BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ和EcoRⅠ均購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；REV-HLJR0901株、gp90單克隆抗體(MAb)均由本實驗室制備并保存；紅外標(biāo)記山羊抗鼠IgG和FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自Sigma公司；HisTrapTM試劑盒購自GE公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；REV抗體ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司。

1.2env基因中BglⅡ和BamHⅠ酶切位點的突變根據(jù)pMD18T-env(HLJR0901)重組質(zhì)粒中的env基因序列，設(shè)計一對用于點突變的引物：env-BmBg-F：5'-CCAAGAGGAGTAGACCTTGATCCCCAGACG TCTG-3'/env-BmBg-R：5'-CAGACGTCTGGGGATCA AGGTCTACTCCTCTTGG-3'，由吉林省庫美生物科技有限公司合成，以pMD18T-env(HLJR0901)重組質(zhì)粒為模板，env-BmBg-F/R為引物進(jìn)行點突變反應(yīng)，突變掉env基因序列中的BglⅡ和BamHⅠ酶切位點，將點突變產(chǎn)物(質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后由吉林省庫美生物科技有限公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18T-Menv。

1.3 重組質(zhì)粒pAO815-2env的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)pMD18T-Menv中點突變后的env基因序列，設(shè)計一對特異性引物用于擴(kuò)增突變后的env基因：815Eco-F：5'-CTAATTATTCGAAACGAGGAATTCGCCA CCATGGACTGTCTCACCAACCT-3'(EcoRⅠ)/815Eco-R：5'-AGTCATGTCTAAGGCGAATTCTCAATGA TGATGATGATGATGTTGACCTAGGGTATCCA-3'(EcoRⅠ)，由吉林省庫美生物科技有限公司合成，以pMD18T-Menv為模板，815Eco-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的點突變后的env基因片段經(jīng)EcoRⅠ酶切后克隆于畢赤酵母表達(dá)載體pAO815中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pAO815-env；經(jīng)BglⅡ/BamHⅠ雙酶切pAO815-env，獲得完整的env表達(dá)盒，將env表達(dá)盒克隆到經(jīng)BamHⅠ酶切的pAO815-env中，經(jīng)PCR鑒定后，得到含有兩個env表達(dá)盒的重組表達(dá)質(zhì)粒pAO815-2env。

1.4 重組菌株pAO815-2env/GS115的構(gòu)建與鑒定將重組質(zhì)粒pAO815-2env經(jīng)SalⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布MD固體培養(yǎng)基(營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定及測序鑒定后，陽性重組菌株命名為pAO815-2env/GS115。

1.5 重組菌株pAO815-2env/GS115的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 將重組菌株接種于YPD平板，30℃培養(yǎng)96 h，挑取單菌落于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基(含甘油，用于擴(kuò)培)中，30℃、200 r/min培養(yǎng)16 h～18 h至OD600nm=2～6；3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入20 mL BMMY液體培養(yǎng)基(含甲醇，用于誘導(dǎo)表達(dá))重懸菌體，30℃、200 r/min，連續(xù)培養(yǎng)120 h，在此期間每隔12 h補(bǔ)加0.5 %(v/v)的甲醇誘導(dǎo)后，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS清洗菌體3次，通過酸洗的玻璃珠振蕩并反復(fù)凍融以破碎酵母菌體，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)。以gp90 MAb(1∶1 000)為一抗、紅外標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶10 000)為二抗，經(jīng)western blot鑒定env蛋白的表達(dá)；經(jīng)進(jìn)一步薄層掃描和Bradford法對表達(dá)的蛋白進(jìn)行定量。

1.6 重組菌株pAO815-2env/GS115的發(fā)酵培養(yǎng)與鑒定 將-70℃保存的重組酵母菌菌種接入MGY液體培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min培養(yǎng)16 h～18 h至OD600nm=2～6，接入發(fā)酵罐，甲醇持續(xù)誘導(dǎo)66 h，每12 h取樣一次，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液12 000 r/min離心30 min，沉淀的菌體經(jīng)玻璃珠振蕩并反復(fù)凍融以破碎酵母菌體，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE，同時以gp90MAb(1∶1 000)為一抗、紅外標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶10 000)作為二抗，經(jīng)western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)；同時，再經(jīng)進(jìn)一步的薄層掃描和Bradford法對發(fā)酵培養(yǎng)獲得的蛋白進(jìn)行定量。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)的env蛋白的純化 取1.6中酵母菌體破碎后的上清，利用HisTrapTM試劑盒純化重組蛋白，收集各步洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測蛋白純化效果，并經(jīng)進(jìn)一步的薄層掃描和Bradford法對純化后的蛋白進(jìn)行定量。

1.8 重組env蛋白的免疫保護(hù)試驗 發(fā)酵培養(yǎng)后純化的env蛋白用PBS稀釋到200μg/mL，添加5 %的吐溫-80，混勻后，與美國白油按1∶1.5(v/v)的比例混合乳化，免疫3周齡的SPF雞，對照組雞注射相同劑量的PBS。實驗組和對照組均為10只/組。一免后3周以相同劑量進(jìn)行二次免疫，一免后1周到6周采集血液，分離血清后用REV抗體ELISA檢測試劑盒檢測雞血清中的抗體滴度。

1.9 SPF雞血清中和抗體的檢測 取上述SPF雞血清樣品，用0.22μm濾器過濾除菌2倍倍比稀釋后與100 TCID50的REV-HLJR0901病毒等體積混合，室溫靜置45 min；取100μL混合液加到CEF中，37℃培養(yǎng)7 d后，以gp90 MAb(1∶200)為一抗，兔抗鼠FITC-IgG為二抗(1∶10 000)，用間接免疫熒光試驗(IFA)檢測血清中的REV中和抗體。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pAO815-2env的構(gòu)建與鑒定 以pMD18T-Menv為模板，815Eco-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段克隆至載體pAO815構(gòu)建重組質(zhì)粒pAO815-env，再用BglⅡ/BamHⅠ雙酶切pAO815-env得到env表達(dá)盒克隆至pAO815-env中，得到重組質(zhì)粒pAO815-2env，以815Eco-F/815Eco-R為引物對該質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得一條約1 700 bp的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1)，經(jīng)測序，其與預(yù)期env基因(GQ415646.2)序列一致，表明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pAO815-2env。

圖1 重組質(zhì)粒pAO815-2env的PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pAO815-2env by PCR

2.2 重組酵母菌pAO815-2env/GS115的篩選與鑒定 重組質(zhì)粒pAO815-2env電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)MD固體培養(yǎng)基篩選后，挑取其中的單菌落為模板，以815Eco-F/815Eco-R為引物對其進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到一條約1 700 bp的條帶，與預(yù)期相符(圖2)，經(jīng)測序，與預(yù)期env基因序列(GQ415646.2)一致，表明env基因已經(jīng)整合到重組酵母基因組中。

圖2 重組酵母菌pAO815-2env/GS115的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant yeast pAO815-2env/GS115 by PCR

2.3 pAO815-2env/GS115的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將重組酵母菌株pAO815-2env/GS115用甲醇連續(xù)誘導(dǎo)120 h后收樣，破碎菌體后取上清，進(jìn)行western blot鑒定。結(jié)果顯示，在約60 ku(未糖基化的蛋白)和80 ku(糖基化的蛋白)處出現(xiàn)條帶，均與預(yù)期相符(圖3)，表明env蛋白在畢赤酵母中得到表達(dá)；經(jīng)過進(jìn)一步的薄層掃描和Bradford法定量，表達(dá)的env蛋白含量約為0.5 g/L。

2.4 pAO815-2env/GS115的發(fā)酵培養(yǎng)與鑒定 重組菌株pAO815-2env/GS115接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，每12 h收樣，破碎菌體后取上清進(jìn)行western blot檢測。結(jié)果顯示，發(fā)酵過程中env蛋白得到了蛋白表達(dá)，且隨著發(fā)酵時間的增加env蛋白的表達(dá)量呈明顯遞增的趨勢(圖4)，經(jīng)薄層掃描和Bradford法定量，env蛋白第66 h的表達(dá)量最高，達(dá)到4.8 g/L，表明env蛋白通過發(fā)酵培養(yǎng)實現(xiàn)了表達(dá)量的顯著提升。

圖3 pAO815-2env/GS115菌株表達(dá)的wetsern blot鑒定Fig.3 Identification of the pAO815-2env/GS115 expression by western blot

圖4 pAO815-2env/GS115菌株發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)的western blot鑒定Fig.4 Identification of fermentation expression of pAO815-2env/GS115 by western blot

2.5 重組蛋白的純化 將2.4獲得的pAO815-2env/GS115發(fā)酵培養(yǎng)上清用His樹脂純化，純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示env蛋白純化效果較好(圖5)，經(jīng)檢測，純化后的env蛋白濃度為2.83 g/L。

圖5 env重組蛋白純化效果的SDS-PAGE檢測Fig.5 Purification of the recombinant Env protein detected by SDS-PAGE

2.6 雞血清ELISA抗體和中和抗體的檢測SPF雞首次免疫后，每周采血，共采集6周，分離血清，用REV抗體ELISA檢測試劑盒檢測血清中的抗體水平。結(jié)果顯示，env蛋白免疫組雞在二免后抗體開始陽轉(zhuǎn)，二免3周后，REV抗體滴度的平均值達(dá)到2246，抗體陽性率達(dá)到70 %，而空白對照組雞沒有檢測到REV抗體(圖6)。經(jīng)中和試驗檢測，首免6周后，env蛋白免疫組雞的中和抗體滴度平均值達(dá)到489，空白對照組雞沒有檢測到中和抗體(圖7)。綜上所述，env蛋白免疫SPF雞后可以刺激其產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)較高水平的抗體和中和抗體的產(chǎn)生，表明重組env蛋白具有良好的免疫原性。

圖6 免疫后SPF雞血清中的ELISA抗體滴度Fig.6 ELISA antibody titer in SPF chicken serum after vaccination

圖7 首免6周后SPF雞血清中的中和抗體滴度Fig.7 Neutralizing antibody titer in chickens at 6 weeks post initial vaccination

3 討論

目前，REV在我國普遍流行。李天琦等通過ELISA方法對10個雞群1 500份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，REV抗體陽性率為17.3%～100%[10]。李衛(wèi)華等對來自20種地方品系雞的1306份血清樣品進(jìn)行了ELISA檢測，結(jié)果顯示，20個雞群均有不同程度的REV感染，REV的抗體陽性率平均為57.12 %[11]。感染情況如此嚴(yán)重，卻沒有商業(yè)疫苗或有效藥物來控制REV感染。

REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，易整合到宿主的基因組中，所以傳統(tǒng)的弱毒疫苗存在很大的風(fēng)險；且REV在體外培養(yǎng)困難，培養(yǎng)時間長，病毒效價低，也不適于滅活苗的研制。隨著基因工程和DNA重組技術(shù)的發(fā)展，亞單位疫苗的應(yīng)用范圍越來越廣，它僅含病原的免疫原性蛋白，不含其它遺傳信息，不會引起宿主發(fā)病，具有良好的穩(wěn)定性和安全性。而制備亞單位疫苗的第一步就是選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)抗原基因。在過去的三十多年中，畢赤酵母已經(jīng)發(fā)展成為一個非常成功的表達(dá)系統(tǒng)。其既有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、易于培養(yǎng)、成本低廉的優(yōu)點，又可以對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，如二硫鍵的形成、糖基化等，這樣表達(dá)的蛋白能夠保持天然的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，具有更好的免疫原性[12]。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種外源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)[13]。

REV的env蛋白屬于囊膜蛋白，是病毒主要的免疫原性蛋白，在病毒組裝過程中會被裂解為gp90和gp20。牛星等將env部分基因以融合蛋白的形式在大腸桿菌中獲得了良好的表達(dá)[14]；瞿曉蘭等利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了env基因中長約939 bp的片段[15]；張文娟和李凱等也利用大腸桿菌表達(dá)了env蛋白[9,16]。但這些均是利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的表達(dá)，有的只是表達(dá)了env基因的一部分，并不能發(fā)揮env蛋白的免疫原性。

因此，本研究第一次利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對REV的env全長基因進(jìn)行表達(dá)，通過親和層析純化，獲得了純度較高的env蛋白，免疫3周齡的SPF雞后，REV的ELISA抗體陽性率達(dá)到70 %，抗體滴度達(dá)到2246，中和抗體滴度高達(dá)489，表明畢赤酵母表達(dá)的env蛋白具有良好的免疫原性，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本研究還通過發(fā)酵培養(yǎng)，較大提升了env蛋白的產(chǎn)量，為RE亞單位疫苗的研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。